血清HBV RNA定量在指导慢性乙型肝炎抗病毒治疗过程中的作用

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1  HBV RNA的形成

在HBV感染过程中，HBV病毒粒子通过与肝细胞受体牛磺胆酸钠协同转运多肽结合，将含有病毒松弛环状DNA（rcDNA）的核衣壳释放到肝细胞，HBV核心颗粒包含的rcDNA通过一系列机制被运输到细胞核，在细胞核中依赖HBV编码的DNA聚合酶补齐两条链上的缺口，最后形成HBV cccDNA^［1］。cccDNA作为病毒转录的模板，可利用宿主细胞的RNA聚合酶进行转录，产生4种不同的RNA（3.5、2.4、2.1、0.7 kb），其中3.5 kb的mRNA有两种：前核心区RNA（PreC RNA）和前基因组RNA（pgRNA），PreC RNA用于编码HBeAg，pgRNA是新病毒逆转录及翻译HBV聚合酶和核心蛋白的模板^［2-3］。在衣壳内，聚合酶通过反转录将pgRNA转化为rcDNA，然后与病毒蛋白装配成新的完整HBV释放到细胞外，或再进入细胞核补充cccDNA池^［4］。有研究^［2］证实，HBV感染者血清中的HBV RNA为pgRNA，其来源可能为核衣壳包裹的pgRNA在未启动逆转录的情况下，直接获得包膜并从感染的肝细胞中释放出来，被称为“HBV RNA病毒样颗粒”。

2  血清HBV RNA与肝脏组织内cccDNA状态的关系

由于肝组织内HBV cccDNA的检测需要做肝组织活检，多数患者不愿意接受，在临床应用中存在较大的困难^［5-7］。HBV pgRNA作为HBV cccDNA的直接转录产物，理论上HBV RNA水平能够反映肝细胞内cccDNA的水平及转录活性。
多项临床及基础研究显示，外周血清中的HBV RNA水平与肝组织内HBV cccDNA密切相关。Wang等^［8］对62例HBeAg阳性和22例HBeAg阴性初治患者研究发现，HBeAg阳性患者的血清HBV RNA定量与肝内cccDNA水平相关性良好，而HBeAg阴性患者的血清HBV RNA与肝内cccDNA无相关性。该研究进一步对41例经核苷（酸）类似物（NAs）治疗2年以上的慢性乙型肝炎（CHB）患者进行了调查。其中，20例患者血清HBV RNA和肝内cccDNA均阳性，9例血清HBV RNA和肝内cccDNA均低于检测下限，12例肝内cccDNA阳性，但血清HBV RNA低于检测下限。分析提示血清HBV RNA与肝内cccDNA的存在与否及转录活性密切相关。另有一项针对47例使用恩替卡韦长期抗病毒治疗且血清HBV RNA检测不到患者的研究^［9］也证实，血清HBV RNA水平与肝内HBV RNA水平（r=0.725，P＜0.001）及肝内HBV RNA/cccDNA比值（r=0.584，P=0.001）密切相关，这些数据表明，血清HBV RNA水平反映了肝内HBV RNA数量和cccDNA的HBV转录活性。Giersch等^［10］对HBV感染小鼠模型血清pgRNA与肝内pgRNA和cccDNA的研究发现，未经治疗的HBV感染小鼠血清pgRNA水平与肝组织内cccDNA水平显著相关，而用PEG-IFNα治疗后的小鼠血清pgRNA与cccDNA无相关性。有研究者^［11］分析认为可能是PEG-IFNα对cccDNA转录翻译的表观遗传修饰降低了cccDNA的活性但不显著影响cccDNA载量，并且PEG-IFNα可加速pgRNA降解或抑制其合成以降低HBV RNA水平，从而导致血清HBV RNA与cccDNA无相关性^［12-13］。由上可知，不同HBeAg状态、不同抗病毒药物等因素均会影响循环HBV RNA的水平，因此，血清HBV RNA作为肝细胞内cccDNA转录活性替代标志物的临床适用性尚待进一步研究。 

3  血清HBV RNA水平与肝组织学活性指标的关系及预测价值

Wang等^［9］研究指出HBV RNA的积累和低水平的病毒复制可能导致肝病进展，该研究发现，血清HBV RNA水平与坏死性炎症和纤维化组织病理学评分密切相关（Metavir炎症分级：r=0.665，P＜0.001；Metavir纤维化分期：r=0.722，P＜0.001）。肝内HBV RNA水平也观察到类似结果。在NAs治疗期间，血清HBV RNA水平在2.45 log10 拷贝/ml时对区分轻度（Metavir评分＜2分）和重度（Metavir评分≥2分）肝组织病理学的准确性最高。这些数据表明，在接受长期NAs治疗的患者中，HBV RNA水平与肝病进展存在关联。并且该研究通过原位杂交的方法观察到HBV RNA严格分布在肝细胞的细胞质中，HBV RNA阳性的肝细胞呈灶状聚集，零星分布于肝小叶，与HBsAg共定位。提示即使在长期恩替卡韦治疗后，病毒转录活性在肝脏的某些解剖部位仍持续存在。

4  CHB患者抗病毒治疗过程中血清HBV RNA水平在病毒学应答中的预测作用

多数研究表明，血清HBV RNA可作为监测抗病毒治疗效果的有用指标。Huang等^［14］一项针对52例CHB患者接受NAs（拉米夫定26例，恩替卡韦26例）抗病毒治疗的研究发现，与血清HBV DNA水平从可检测到不可检测时间间隔≥16周的CHB患者相比，间隔＜16周的患者在治疗第12周时血清HBV RNA水平显著降低。血清HBV RNA是此类患者最初病毒学反应（HBV DNA首次小于检测值下限）的唯一独立治疗预测因子。印度的一项研究^［15］对91例HBeAg阴性CHB患者的血清样本进行了回顾性分析，这些患者曾单独应用PEG-IFN或联合恩替卡韦抗病毒治疗48周，在治疗后3年的随访中，维持病毒学应答率（定义为持续HBV DNA＜2000 IU/ml）和HBsAg清除率分别为37.4%（34/91）和7.7%（7/91）。治疗前血清低水平的HBV RNA和HBsAg与维持病毒学应答独立相关。由此提出在PEG-IFN治疗前HBV RNA水平可以预测获得维持病毒学应答的高概率患者，有助于个体化决策。

对于HBeAg阳性患者，无论是自发还是治疗诱导的血清学转换，都被认为是HBsAg丢失或血清转换的先决条件。血清HBV RNA水平可作为NAs治疗过程中HBeAg血清转换的早期预测指标。van Bömmel等^［16］在对50例接受富马酸替诺福韦酯或拉米夫定治疗的HBeAg阳性患者的研究中指出，治疗过程中患者血清HBV RNA水平的变化与有无发生HBeAg血清学转换密切相关。与未发生HBeAg血清学转换的患者相比，发生血清学转换患者治疗过程中HBV RNA水平下降更快。多因素分析显示，与HBV RNA、HBsAg、ALT、HBV基因型、年龄和性别相比，治疗第3个月和第6个月HBV RNA水平下降是HBeAg血清转换的最强预测因子。Luo等^［17］对98例应用NAs抗病毒治疗长达7年的CHB患者进行研究，logistic回归模型显示治疗48周后HBV RNA阳性是HBeAg未清除的危险因素（风险比=6.69），并且在NAs长期抗病毒治疗过程中，血清HBV RNA阳性患者也需要更多的时间来达到HBeAg清除。因此，治疗48周后HBV RNA阳性患者更难达到治疗终点，这些患者在治疗过程中亦会产生更大的经济压力。
由于NAs与IFN抗病毒治疗机制不同，故血清HBV RNA的临床应用意义在这两种治疗方案中也存在差别。研究^［18］指出，CHB患者在抗病毒治疗过程中，IFN为基础的治疗比单用NAs治疗更能降低HBV RNA载量，即使是HBeAg阳性患者在接受以IFN为基础的抗病毒治疗时，其HBV RNA载量的降低也高于NAs治疗的患者。在IFN治疗中，基线低水平的HBV RNA可预测HBeAg血清学转换的发生，van Bömmel等^［19］回顾性分析了接受PEG-IFNα-2a抗病毒治疗的131例HBeAg阳性患者的血清标本，其中76例接受PEG-IFNα-2a单药治疗，55例接受PEG-IFNα-2a联合拉米夫定治疗，结果显示，51%（39/76）的单药治疗患者及47%（26/55）的联合治疗患者发生了HBeAg血清学转换，HBeAg血清学转换患者基线血清HBV RNA水平显著低于无应答者，在治疗过程中和治疗后随访的各个时间点，发生HBeAg血清学转换的患者HBV RNA中位水平均较未发生转换的患者低，治疗12周和24周患者的HBV RNA水平显示出良好的预测HBeAg血清学转换率的能力。张继明教授团队［20］的一项研究得出了相似的结论。因此在HBeAg阳性的CHB患者中，血清HBV RNA水平可作为一种预测HBeAg血清学转换的新工具。

5  血清HBV RNA是CHB患者NAs停药后复发的潜在预测因子

既往研究指出，以持续的HBV DNA未检出（低于检测下限）、ALT水平正常和HBeAg血清学转换为前提停药，仍存在很大的病毒学反弹和疾病复发风险。血清HBV RNA被认为是与cccDNA转录活性相关的临床指标，血清HBV RNA的消失可能反映cccDNA的消失或转录沉默，并可能是抗病毒治疗安全停药的指标^［8-9］。
Wang等^［2］对33例接受标准NAs抗病毒治疗且在治疗结束时HBV DNA水平低于检测下限的CHB患者进行随访，以治疗结束后24周HBV DNA的重新出现作为研究终点，其中21例HBV RNA在治疗结束时呈阳性的患者均出现了反弹，而12例HBV RNA水平低于检测值下限的患者中仅有3例出现病毒反弹。该研究提示血清HBV RNA水平可能与停止NAs治疗后HBV反弹的风险有关。另一项对36例CHB患者应用NAs治疗的研究^［21］发现，治疗3个月时患者血清HBV DNA和HBV RNA水平与停药24周后HBV DNA、ALT水平升高相关，监测此时间点的HBV DNA和HBV RNA水平可预测停止NAs治疗后CHB患者的肝脏炎症再活动。此结果在一项多中心前瞻性研究^［22］中得到了验证。该研究对130例HBeAg阳性接受替比夫定联合或不联合阿德福韦酯抗病毒治疗的慢性HBV感染者进行了长期的随访。结果显示，与HBV DNA或RNA阳性患者相比，治疗结束时HBV DNA及RNA均阴性的患者临床复发风险显著降低（8.0% vs 31.4%）；多元回归分析显示，治疗结束时HBV DNA和RNA水平是临床复发（HBV DNA＞2000 IU/ml且ALT＞2倍正常值上限）（危险比=4.54）和病毒学复发（两次检测HBV DNA＞2000 IU/ml）（危险比=11.10）的独立预测因子，认为HBV总核酸水平（HBV DNA和HBV RNA）可以作为一个可靠的生物标志物来指导停药。同时，有必要开发一种新的试剂盒，可以直接检测HBV总核酸水平，以便更好、更简单地监测治疗反应和指导停药。
血清HBsAg阴性有可能是由于S基因突变介导的HBsAg检测能力差，而非真正的血清HBsAg清除^［23］。经抗病毒治疗后实现HBsAg消失的CHB患者仍会出现病毒反弹的风险^［24］。有研究^［25］指出血清HBV RNA可作为HBsAg逆转的潜在预测因子。该研究对32例接受PEG-IFN单独或联合NAs治疗后HBsAg和HBV DNA均达到血清学清除的CHB患者进行评估，治疗结束时HBV RNA阳性的7例患者在停药后均出现HBsAg和HBV DNA逆转，而25例HBV RNA阴性患者中只有5例出现HBsAg逆转和HBV DNA重现。治疗结束时血清HBV RNA水平预测复合逆转（包括HBsAg逆转和HBV DNA重现）的阳性预测值为100%，阴性预测值为80%，表明在治疗结束时血清HBV RNA阳性可以预测停药后复合逆转的风险。小结
HBV RNA是一种新型HBV血清学标志物。近年来有关血清HBV RNA的研究越来越受到关注，虽然检测方法各不相同，但已显示出其初步的临床意义。未来仍有许多问题有待探索。首先，血清HBV RNA的分子特征尚未明确，需要进一步的基础研究确定血清HBV RNA的分子生物学特性，并评估其临床潜力。其次，目前仍缺乏一种标准化的血清HBV RNA检测方法，应制订和研究一种标准化的，快速简单、灵敏、稳定以及可重复的 HBV RNA检测方法，用以满足临床HBV RNA快捷和可重复的检测需求。最后，多项研究指出HBV RNA在抗病毒疗效评价及预测停药复发中的价值，通过HBV RNA检测来预测和优选HBsAg清除优势人群，可能有助于大幅度提高NAs经治CHB患者的临床治愈率，但HBV RNA单独或联合其他指标预测治疗终点仍需大样本的前瞻性研究支持。

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引证本文：卞丹丹, 郑素军. 血清HBV RNA定量在指导慢性乙型肝炎抗病毒治疗过程中的作用[J]. 临床肝胆病杂志, 2020, 36(8): 1838-1841.

本文编辑：葛俊

公众号编辑：邢翔宇

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