PNAS | 生长激素释放激素受体的结构性信号偏向转导机制

2021年10月2日（北京时间），中国科学院上海药物研究所王明伟/杨德华团队和徐华强团队携手程曦/蒋华良团队在《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）在线发表了题为“Constitutive signal bias mediated by the human GHRHR splice variant 1”的研究成果。这篇由2012年诺贝尔化学奖得主Robert J. Lefkowitz教授主审的直投（PNAS Direct Submission）论文首次报道了B1类G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor, GPCR）结构性信号偏向转导机制，也是将结构生物学用于分子药理学研究的又一成功范例。

作为体内最大的膜蛋白家族，GPCR通过G蛋白依赖和非依赖方式（如β-Arrestin募集）向胞内转导信号。对某种转导途径具有偏向性的配体能够更为精确地调节受体的功能¹。除了配体介导的信号偏向转导外，同一受体在不同细胞或组织中也存在这种现象，通常是由基因变异所致，即结构性偏向转导²。基因的剪接变异是一种常见的细胞功能调控拓展形式，存在于各类GPCR家族，约40%的GPCR拥有至少一种剪接变异体²。因此，研究信号偏向性转导的结构生物学基础将有助于药物的精准设计。

生长激素释放激素受体（Growth hormone-releasing hormone receptor, GHRHR）属于B1类GPCR家族，主要分布于垂体中，通过调控生长激素的合成与分泌维持人体正常的生长与发育³。然而，GHRHR及其剪接变异体在肿瘤病理进程中的作用也一直受到业界的关注。在已报道的4种GHRHR剪接变异体中，SV1与GHRHR高度相似，仅在受体胞外域（ECD）存在区别，原因是受体氨基端的一段外显子被第三个内含子替换，使得前89个氨基酸被替换成了另外25个氨基酸，导致氨基端缺失一段序列⁴。即便如此，SV1依然保留了完整的GPCR结构和功能。前人研究表明，GHRHR和SV1在10多种肿瘤组织中均有表达，后者特有的缺氧微环境能诱导GHRHR发生剪接变异，使SV1的表达量升高，进而加快癌细胞的增殖与迁移⁵。显然，剪接变异引起的结构变化可以引起某个信号通路发生偏向转导从而改变受体的功能。

继2020年10月报道GHRHR的配体识别、受体活化及疾病发生的分子机理后⁶，该团队将研究方向聚焦于更具挑战性的剪接变异体。经过近一年的探索，他们发现GHRHR和SV1在下游信号转导分子的选择上表现出明显的偏向性，SV1偶联G_s蛋白和触发cAMP反应的能力比GHRHR减弱了近1000倍，但它对β-Arrestin招募和ERK1/2激活具有明显优势，提示SV1可能通过β-Arrestin调控ERK1/2信号转导来促进细胞增殖，而GHRHR则主要经G_s-cAMP通路调节生长发育（图1）。该团队还通过结构生物学和分子动力学模拟手段剖析这种信号偏向性转导的分子机制。

图1. GHRHR和SV1引起信号偏向性转导的分子机制。

基于先前解析GHRHR三维结构的方法，该团队应用冷冻电镜技术分别测定了分辨率为3.3Å的GHRH-SV1-G_s三元复合物和2.6Å的SV1-G_s二元复合物结构（图2A和2B）。与活化的GHRHR结构相比，SV1在激活过程中其ECD与GHRH之间没有稳定的相互作用，而激活态的GHRHR其ECD的一些关键氨基酸（如L34、L62、F82和 F85）和GHRH产生较强的相互作用，从而稳定了配体之结合。正是这些关键相互作用的缺失导致SV1对G_s激活能力大大减弱（图2C）。

图2. SV1激活G_s能力减弱之分子基础。A，GHRH-SV1-G_s三元复合物结构；B，SV1-G_s二元复合物结构；C，激活态GHRHR和SV1结构的比对。

分子动力学模拟分析发现，在SV1招募β-Arrestin 1的过程中，由于缺少ECD的相互作用，GHRH与受体结合后发生朝向ECL1的位移，导致配体结合口袋的构象变化。此外，GHRH结合GHRHR时与ECL2形成了较多的相互作用，通过维持ECL2的构象使得TM3、TM5和TM6更加靠近配体结合口袋，发挥稳定TMD的效应。然而，由于SV1与ECL2之间并没有相互作用，TM3、TM5和TM6的间距增大，SV1与β-Arrestin 1的结合口袋比GHRHR增加了近300ų，使得β-Arrestin 1在SV1中的结合位置更深，更加靠近配体结合口袋（图3），相应氨基酸的点突变实验也佐证了这种结构性信号偏向转导的分子机制。

图3. SV1招募β-Arrestin能力增强的分子基础。A，GHRHR和SV1的β-Arrestin 1激活体系；B，GHRHR（左）和SV1（右）的构象变化。

中国科学院上海药物研究所/复旦大学王明伟讲座教授、中国科学院上海药物研究所杨德华研究员、徐华强研究员和程曦副研究员为该论文的共同通讯作者；复旦大学基础医学院博士后研究助理丛朝彤、上海药物研究所博士后研究助理周富来、上海科技大学硕士研究生张超和华中科技大学硕士研究生邹欣宇为共同第一作者。合作者包括中国科学院上海药物研究所蒋华良研究员、华中科技大学夏天教授和复旦大学基础医学院周庆同青年研究员等。

原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2106606118

参考文献

1 Rominger,D. H., Cowan, C. L., Gowen-MacDonald, W. & Violin, J. D. Biased ligands:pathway validation for novel GPCR therapeutics. Current opinion in pharmacology 16, 108-115, doi:10.1016/j.coph.2014.04.002 (2014).

2 Marti-Solano, M.et al. Combinatorial expression of GPCR isoforms affects signalling and drug responses. Nature 587, 650-656,doi:10.1038/s41586-020-2888-2 (2020).

3 Gaylinn, B. D. Growth hormone releasing hormone receptor. Receptors & channels 8, 155-162 (2002).

4 Rekasi, Z., Czompoly, T., Schally, A. V. & Halmos,G. Isolation and sequencing of cDNAs for splice variants of growth hormone-releasing hormone receptors from human cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 10561-10566,doi:10.1073/pnas.180313297 (2000).

5 Xiong, X. et al. Splice variant of growth hormone-releasing hormone receptor drives esophageal squamous cell carcinoma conferring a therapeutic target. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 117, 6726-6732,doi:10.1073/pnas.1913433117 (2020).

6 Zhou, F. et al. Structural basis for activation of the growth hormone-releasing hormone receptor. Nature communications 11, 5205,doi:10.1038/s41467-020-18945-0 (2020).

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