PNAS | 人源甲状旁腺激素受体2复合物三维结构成功解析

2021年8月6日（北京时间），由中国科学院上海药物研究所王明伟/杨德华团队和徐华强/赵丽华团队携手蒋华良/程曦团队于《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）在线发表了题为“Molecular insights into differentiated ligand recognition of the human parathyroid hormone receptor 2”的研究成果。这篇由2012年诺贝尔化学奖得主Robert J. Lefkowitz教授主审的直投（PNAS Direct Submission）论文首次报道了人源甲状旁腺激素受体2（Parathyroid hormone receptor 2, PTH2R）与其内源性配体和G_s蛋白复合物的冷冻电镜结构，揭示了PTH2R的配体选择性、拮抗作用及疾病发生的分子机制，为相关新药的研发奠定了坚实的基础。

PTH2R是B1类G蛋白偶联受体家族成员，由550个氨基酸组成，主要分布在脑部，参与疼痛传导^{1, 2}、伤口愈合³和机械感知⁴。PTH2R也可调控钙离子转运，改善角质细胞分化，是Darier病和Hailey-Hailey病的潜在治疗靶点^{5, 6}。PTH2R和甲状旁腺激素受体1（Parathyroid hormone receptor 1, PTH1R）的天然配体包括甲状旁腺激素（Parathyroid hormone, PTH）、肺漏斗肽39（Tuberoinfundibular peptide 39, TIP39）和甲状旁腺激素类似肽（Parathyroid hormone-related peptide, PTHrP）。PTH2R可被TIP39和PTH识别，但PTH1R只能被PTHrP和PTH激活⁷。先前该团队主要成员通过解析PTH1R与长效甲状旁腺激素（Long-acting parathyroid hormone, LA-PTH）复合物的三维结构，发现PTH1R胞外侧结构域极具灵活性⁸，但PTH2R和PTH1R特异性识别内源配体的分子机制尚不明了。参加这项研究的科研人员经过前期载体筛选和应用NanoBiT系连技术⁹获得了颗粒均一且性状稳定的高质量蛋白复合物。借助中国科学院上海药物研究所300 kV冷冻电镜拍摄到的清晰图像和后继单颗粒三维重构获得了分辨率为2.8 Å的TIP39–PTH2R–G_s三元复合物的立体结构（图1）。

图1. TIP39激活的PTH2R与G_s蛋白的冷冻电镜结构。左，TIP39–PTH2R–G_s复合物结构；右，TIP39与PTH2R结合模式。

该项研究揭示，PTH2R内源配体TIP39呈现两亲性α螺旋，羧基端与胞外结构域作用，氨基端则插入受体跨膜结构域。与以往已解析的B1类GPCR结构不同，TIP39末端氨基与自身氨基酸残基以氢键方式形成闭合环状结构，较深地插入至跨膜结构域（图1）。与PTH1R相比，PTH2R的第一跨膜螺旋更长，向受体中心弯折，且第一跨膜螺旋与TIP39相互作用（图2），这可能是PTH2R选择性识别配体的结构基础。分子动力学模拟和点突变实验证明PTH2R的Y318^5.39b、K197^2.67b和R305^ECL2参与配体的特异性识别（图2）。截短TIP39的氨基端则使之成为PTH2R的拮抗剂即TIP(7-39)。分子动力学模拟结果表明，TIP(7-39)与PTH2R相互作用导致第六跨膜螺旋弯折的角度相比全长TIP39所引起的弯折角度为小，从而解释了TIP(7-39)拮抗作用的分子机制。基于TIP39–PTH2R–G_s复合物结构，引入导致生长发育迟缓的G258D突变，分子动力学模拟发现该变异受体胞内侧疏水作用被破坏，与G蛋白结合能力减弱，点突变实验也佐证了这一结论。

图2. PTH1R和PTH2R特异性识别配体的分子基础。上，PTH2R结合TIP39与PTH1R结合LA-PTH的构象比较；下，配受体作用模式图。

中国科学院上海药物研究所/复旦大学王明伟讲座教授、中国科学院上海药物研究所杨德华研究员和徐华强研究员为该论文的共同通讯作者；中国科学院上海药物研究所硕士研究生王希、程曦副研究员和赵丽华副研究员为共同第一作者。合作者包括中国科学院上海药物研究所蒋华良研究员、华中科技大学夏天教授和复旦大学基础医学院周庆同青年研究员等。该研究成果的第一完成单位是中国科学院上海药物研究所，先后获得了国家自然科学基金委员会、国家科技重大专项、国家重点基础研究计划、中国科学院先导专项、上海市科技发展基金和诺和诺德-中科院研究基金等的经费资助。

原文链接：

https://www.pnas.org/content/118/32/e2101279118

参考文献

1. Dobolyi, A., Ueda, H., Uchida, H., Palkovits, M. & Usdin, T. B. Anatomical and physiological evidence for involvement of tuberoinfundibular peptide of 39 residues in nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1651–1656 (2002).

2. Dimitrov, E. L., Kuo, J., Kohno, K. & Usdin, T. B. Neuropathic and inflammatory pain are modulated by tuberoinfundibular peptide of 39 residues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 13156–13161 (2013).

3. Sato, E. et al. Activation of Parathyroid Hormone 2 Receptor Induces Decorin Expression and Promotes Wound Repair. J. Invest. Dermatol. 137, 1774–1783 (2017).

4. Anneser, L. et al. The neuropeptide Pth2 dynamically senses others via mechanosensation. Nature 588, 653–657 (2020).

5. Sato, E. et al. The Parathyroid Hormone Second Receptor PTH2R and its Ligand Tuberoinfundibular Peptide of 39 Residues TIP39 Regulate Intracellular Calcium and Influence Keratinocyte Differentiation. J Invest Dermatol. 136, 1449–1459 (2016).

6. Palareti, G. et al. The parathyroid hormone family member TIP39 interacts with sarco/endoplasmic reticulum Ca-ATPase activity by influencing calcium homeostasis. Int. J. Lab. Hematol. 38, 42–49 (2016).

7. Usdin, T. B., Hoare, S. R. J., Wang, T., Mezey, É. & Kowalak, J. A. TIP39: A new neuropeptide and PTH2-receptor agonist from hypothalamus. Nat. Neurosci. 2, 941–943 (1999).

8. Zhao, L. H. et al. Structure and dynamics of the active human parathyroid hormone receptor-1. Science 364, 148–153 (2019).

9. Duan, J. et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nat. Commun. 11, 4121 (2020).

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