火石研究院 | SNP检测方法盘点
SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。随着精准医学的提出，SNP在比较个体间基因差异、疾病相关基因诊断、药物开发与合理用药中的作用被进一步提升。
1 什么是SNP?
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP，它包括单碱基的转换，颠换、插入及缺失等形式。
2 SNP检测方法有哪些？
SNP检测方法众多，大约有20多种。总体来说，检测SNP大概有3种途径:a通过检测未知突变(以构象为基础)途径，比如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、化学或酶错配修饰分析、单链构象多态性(SSCP)、变性高效液相色谱等; b通过已知多态性检测(以凝胶为基础)途径，包括PCR，RFLP、寡核苷酸连接分析等;c通过检测非凝胶高通量途径，包括TaqMan核酸酶等位基因特异性杂交分析、DNA芯片、直接测序和质谱技术等。目前针对消费者SNP检测应用最为广泛的为DNA芯片法，包括Thermo Fisher公司的原位芯片和Illumina公司的微珠芯片。
3 不同检测方法的检测原理是什么？
3.1 限制性片段长度多态性法PCR-RFLP：
原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。
特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一。
3.2 单链构象多态性法PCR-SSCP：
原理：单链DNA在中性条件下会形成二级结构，不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。
特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。
3.3 等位基因特异性PCR
原理：根据SNP位点设计特异引物，其中一条链(特异链)的3′末端与 SNP位点的碱基互补(或相同)，另一条链(普通链)按常规方法进行设计，因此，AS-PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物，在另一种基因型中没有扩增产物，用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定基因型的SNP。
3.4 SNaPshot法
该技术基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’-端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于10-30个SNP位点分析。
3.5 SNPlex法
SNPlex法是基于荧光检测方法来进行，原理如下：DNA 模板直接与一套3个探针组成的系统结合，这 3个探针包括 2个等位基因特异探针ASO 和1个位点特异探针LSQ[IO]。当ASO探针和 LSO探针与模板完全匹配时，连接酶连接两条探针。然后，使用生物素标记的PCR引物扩增该连接产物。生物素标记的扩增产物结合在链霉亲和素包被的杂交板孔中，通过碱变性的方法使生物素标记的单链PCR产物保留在杂交板中，然后该单链PCR产物与一套通用Zipchute探针杂交结合。这些探针带有荧光标记，它们具有特殊的片段与单链PCR产物的特殊部位互补，还包含有修饰部分，一条Zipchute探针对应一个待检测等位基因。然后将杂交捕获到的Zipchute探针分离出来，通过毛细管电泳进行检测，最后通过 GeneMapper软件分析来确定SNP基因型。
3.6 TaqMan探针法
针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当溶液中存在PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET，发出荧光。通常用于少量SNP位点分析。
3.7 测序法
原理：测序法可以分为Sanger测序法、焦磷酸测序法、微测序法、二代测序法。以二代测序法为例，通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较，以确定所研究的碱基是否变异，其检出率可达100%。
特点：可以得到SNP的类型及其准确位置等SNP分型所需要的重要参数。目前检测分为约为1-2万人民币左右。
3.8 芯片法
原理:基因芯片是在固相支持介质上进行分子杂交并原位荧光检测的一种高通量 SNP 分析方法。根据核苷酸的碱基配对原理，设计两种或多种探针，在优化操作后，探针只与其完全互补的序列杂交，不与含有单个错配碱基的序列杂交。待测基因经提取扩增、荧光化学标记后，与固定的探针进行杂交。然后洗去没有发生杂交的样品，即可检测杂交样品。由于目标基因和探针杂交的程度与荧光强度及种类相关，因此通过激光扫描，可根据荧光强弱或荧光的种类检测出被检序列的碱基类别。目前的生产SNP芯片的公司主要有Thermo Fisher、Illumina和Agilent。但是三个公司各自的检测原理不尽相同。
特点：其优点是高通量，一次实验可对多个进行大规模筛选，需要少量的被检起始材料，操作步骤简便。目前检测费用在1000元以内。其中23魔方，WeGene的检测费用在500元以内，市场空间巨大。
3.9 飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)检测
原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后，在硅芯片上进行引物的退火，延伸反应，突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。
3.10 变性高效液相色谱(DHPLC)法
原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后，含有突变碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来，从而达到分离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目差异，依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的碱基。
特点：使用高效液相色谱检测SNPs具有检测效率高，便于自动化的优点，对未知SNPs的准确率可达95%以上。但DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高，容易产生误差，不能检测出纯合突变。
4 SNP检测未来的方向在哪里？
一个理想的检测 SNP 的方法必须具备以下优点: a适合自动化操作，简便、迅速; b分析费用低，特殊试剂用量少; c即使不纯的样品也可得到可靠的结果; d数据分析简单，易于自动化分析; e反应的通量要大而灵活，一天可以完成几百到上百万个样品。目前报道的SNP检测方法中，尽管有些方法成本低，但速度慢，且不适合自动化分析; 有些方法可自动化高通量分析，但制备探针成本高。总的来说，伴随着分子生物学技术的突破，定将会有更多的SNP检测技术和方法不断涌现，SNP的应用价值将会不断得以发掘和体现，人类SNP的研究及应用将会在遗传及医学领域中的发挥重要作用。
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