匹配白细胞DNA测序确定cfDNA突变来源，更好地发挥cfDNA临床价值
鉴于液体活检副作用小、非侵入式、操作简便、无需影像学支持、可重复取样、可有效应对肿瘤异质性、早于影像学检测且成本低等一系列优势，其在癌症筛查、癌症诊断、治疗方案的选择、预后实时监测、预后评估等全周期健康管理中表现出了巨大潜力和作用。而作为液体活检的主要生物标志物——血液中的cfDNA（circulating cell-free DNA，即循环游离DNA，通常是指长度为150-200 bp双链DNA小片段），在研究的不断积累与支撑之下，已广泛用于癌症检测、无创产前筛查等领域。
由于cfDNA液体活检方法的可及性高、侵入性低等因素，结合NGS技术的外周血浆样本分析正逐步纳入到肿瘤临床检测中。具有高灵敏度的cfDNA突变检测技术将有助于液体活检的临床应用。其中，关键的问题和挑战是区分这些突变是否确实来自于肿瘤，而不是其他组织。cfDNA在血浆中的含量极低，每1mL血浆仅有10-30ng的cfDNA，而这其中又仅有0.01-0.1%是来源于肿瘤的ctDNA（circulating tumor DNA, 循环肿瘤DNA）。
针对这一问题和挑战，近日纪念斯隆·凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center, MSKCC）和GRAIL的联合研究团队，带来了一项重要研究成果，发表在《自然·医学》杂志上，文章题目为《超深度测序揭示血浆游离DNA的突变来源》 （Razavi, P., Li, B.T., Brown, D.N.et al. High-intensity sequencing reveals the sources of plasma circulating cell-free DNA variants. Nat Med 25, 1928–1937 (2019)）。
这项研究对124例癌症患者的cfDNA和白细胞DNA，以及47名健康志愿者的cfDNA和白细胞DNA，进行了超高深度测序（60000×）。作者发现，肿瘤患者血液cfDNA中携带的部分基因突变，可能不是来自于癌细胞，而是血液中的白细胞。这对cfDNA液体活检相关的研究提出了要求，在给患者开展液体活检时，应该同时对白细胞DNA进行检测。
无独有偶，在早些时候的美国人类遗传学会（The American Society of Human Genetics, ASHG）上，Beckman Coulter公司展示了一篇基于Apostle南科征途产品产生的科研海报《Comparison between mutation profiles of paired whole blood and cfDNA samples》，探索了白细胞DNA和cfDNA突变图谱的关系和区别，颇有先见之明地提出了配合两者测序结果，区分cfDNA来源于肿瘤的变异，可以作为开展相应的ctDNA分析的起点。
在《自然·医学》杂志上的这篇文章，介绍了一种超深度白细胞DNA-cfDNA匹配测序技术，并比较了cfDNA、白细胞DNA和组织样本的测序结果。文章系统分析了cfDNA检测的技术特长、cfDNA在肿瘤突变负荷（TMB）检测中的优越性以及cfDNA突变的来源，充分展示了cfDNA在肿瘤领域相较于传统组织活检的优势，同时也对cfDNA用于肿瘤液体活检提出了新的建议和要求。
图1. 文章实验流程
文章研究人员招募了124名癌症患者，其中乳腺癌（metastatic breast cancer, MBC）患者39名，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者41名，前列腺癌（castration-resistant prostate cancer, CRPC）患者44名。另外还招募了47名没有癌症的健康志愿者，作为对照样本。
研究人员从癌症患者身上获取了肿瘤组织样本、cfDNA和白细胞DNA，从无癌健康志愿者身上获取了cfDNA和白细胞DNA样本。对血浆cfDNA和白细胞DNA样本进行了超高深度（60000x）的测序，对肿瘤组织样本使用美国FDA批准的MSK-IMPACT（Memorial Sloan Kettering integrated mutation profiling of actionable cancer targets）平台进行了测序。
在cfDNA突变与肿瘤组织活检的一致性上，cfDNA测序在84%（104/124）的肿瘤患者中检测出了与肿瘤组织一致的突变，同时，72%的肿瘤组织突变（530/740）也能够通过cfDNA被检测出。此外，在cfDNA中检测到了低于组织活检常规检测阈值的突变（biopsy subthreshold）和大量在肿瘤组织和白细胞中检测不到的未知来源突变（variants of unknown source, VUSO）。这些未知来源突变可能反应了肿瘤的演变和异质性，而携带这部分突变的肿瘤组织在单次、受限的活检中未被采集。
与以往的大量研究相符，cfDNA液体活检与组织活检测序得到的突变具有良好的一致性。同时，cfDNA测序检测到的VUSO展示了液体活检在肿瘤领域的技术优势，更全面地呈现肿瘤的遗传突变信息。
通过MSK-IMPACT测序平台检测肿瘤组织活检样本，发现了6例高TMB患者，其中4例同时也被cfDNA测序认定为高TMB。此外cfDNA测序额外检测出了6例未被组织活检发现的高TMB患者，这差别可能是由于迁移肿瘤的空间异质性造成的，呈现高TMB的肿瘤亚克隆未被组织活检所采集。这10例cfDNA测序确定的超突变患者（hypermutated）占据了低于阈值突变（biopsy subthreshold）和未知来源突变（VUSO）的75%（1083/1447）。cfDNA测序在检测TMB上较肿瘤组织活检更为有利。
图4. cfDNA突变来源分析
在健康无癌志愿者中，cfDNA测序得到的突变有81.6%（297/364）同样被白细胞DNA测序检测到（WBC matched）；在非超突变患者中这一数值为53.2%（918/1727），这些白细胞匹配的突变与肿瘤匹配突变无相关性，而与年龄具有相关性，说明这部分突变很有可能是来源于克隆造血。克隆造血带来的突变可能比以往预期的更为普遍，作者据此对 cfDNA液体活检用于肿瘤检测领域提出了建议和要求，应当同时匹配白细胞DNA测序，确定cfDNA的突变来源，找到来源于肿瘤的ctDNA。
此外，cfDNA测序中77.7%（994/1280）的未知来源突变（VUSO）来自于10例的超突变患者。由于肿瘤的空间异质性和活检的取样限制，肿瘤组织活检无法检测到很多亚克隆突变，尤其是在高TMB患者中。通过相应的基因分析和ddPCR的验证，这些VUSO很可能大部分也来自于超突变肿瘤的亚克隆，而这无法被传统组织活检测序检测到，体现了cfDNA液体活检检测的独特优势和临床价值。
文章充分肯定了cfDNA液体活检的技术特长和优势，而为了更好地发挥cfDNA的临床价值，减少白细胞突变带来的影响，找到来源于肿瘤的微量的ctDNA，文章也强调了应当同时开展白细胞DNA测序。这也印证了Beckman Coulter公司早些时候10月份在美国人类遗传学会（ASHG）上发表的科研海报，体现匹配白细胞DNA测序在cfDNA液体活检检测中的重要性。
图5. cfDNA、白细胞DNA提取试剂盒和自动化工作站
Beckman Coulter的研究人员使用了Apostle南科征途的高效游离DNA分离富集试剂盒（Apostle MiniMax™ High Efficiency Cell-Free DNA (cfDNA) extraction kit），搭配Beckman Coulter的全自动液体工作站Biomeki-Series，从大体积血液样本中自动化高效地提取了cfDNA。对于同一血液样本中的白细胞DNA，则使用了Biomek i-Series搭配基因组DNA提取试剂盒GenFind V3提取。
研究人员在白细胞DNA中平均检测到了29个突变，在cfDNA中平均检测到了55个，大部分突变在两种样本上都能被检测到。进一步分析发现在所有样本中仅在cfDNA测序中发现的突变数目是仅在白细胞DNA中发现突变数目的10倍以上。通过匹配白细胞DNA测序，这些仅在cfDNA测序中发现的突变可以有效去除白细胞引入突变的影响，很可能是来源于肿瘤组织，这些突变可以作为肿瘤ctDNA分析的起点。
这篇海报展示了通过全血单一样本来源，搭配南科征途的高效游离DNA分离富集试剂盒和基因组DNA提取试剂盒GenFind V3，可以更为全面地解析肿瘤的突变信息，确定cfDNA的突变来源，发挥cfDNA液体活检的临床价值。
这两项研究充分展示了cfDNA液体活检具有传统组织活检无可比拟的优势，特别是在检测肿瘤异质性、肿瘤亚克隆突变和TMB中。同时也对cfDNA液体活检研究提出了新的要求和挑战，由于cfDNA中仅有少量来自于肿瘤组织的ctDNA，在开展相关肿瘤检测时，应该同时对白细胞DNA进行测序，以确定cfDNA突变的来源，更好地发挥cfDNA的临床价值。
未来，cfDNA液体活检领域将会是挑战与机遇并存，如何高效高纯度提取cfDNA、高灵敏度检测cfDNA突变、准确追寻cfDNA突变来源是cfDNA临床应用的关键，而另一方面，与传统的组织活检相比，通过抽取血液等体液标本检测cfDNA的液体活检方法具备实时动态检测、克服肿瘤异质性、提供全面检测信息等独特优势。这种技术能够有效的解决精准医疗的痛点，通过非侵入性取样降低活检危害，有效延长患者生存期。cfDNA在癌症领域的有效性已经被大量研究所证明，cfDNA检测在肿瘤筛查、用药指导、监控治疗耐药性、监测疾病复发等肿瘤检测场景上表现出巨大的临床应用潜力和应用价值，受到大量资源和资本的青睐，吸引了无数的科学家、临床工作者和创业家，基于液体活检的肿瘤基因检测将推动精准医学迈向一个新时代。液体活检技术的发展和衍生，未来5-20年，将对人类对抗癌症，产生一个革命性的科学和产业影响。
参考文献：
Razavi, P.,Li, B.T., Brown, D.N. et al. High-intensity sequencing reveals the sources ofplasma circulating cell-free DNA variants. Nat Med 25, 1928–1937(2019) doi:10.1038/s41591-019-0652-7
Patel A.,Saunders L., Hur A. Comparison between mutation profiles of paired whole bloodand cfDNA samples. The American Society of Human Genetics (ASHG).(Independent conference abstract, #1767). Houston, TX. Oct 15, 2019
关于深圳市南科征途有限公司
深圳市南科征途有限公司是位于中国深圳市的一家生物科技公司，旨在开发液体活检领域的创新技术 - 非固体生物组织（主要是血液）的采样和分析，通常利用循环游离DNA（cfDNA）作为生物标志物。Apostle的创新技术包括Apostle MiniMax™，一种新的可扩展且可自动化的方法，可以从常规外周血中高效捕获cfDNA；Apostle MagTouch™，业界领先的游离核酸和基因组核酸自动化提取解决方案；Apostle cfDNA Blood Collection Tube，高保真游离核酸保存技术用于外周血的采集、储存和运输等。
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