南京邮电大学范曲立教授：多聚赖氨酸修饰NIR-II荧光探针的制备及在树突状细胞(DC)疫苗归巢过程中的示踪应用

南京邮电大学范曲立教授团队针对树突状细胞(DC)免疫治疗中归巢过程难以进行实时活体监控的难题，开发了具有高载运效率的近红外二窗（NIR-II）荧光探针，用于抗原的载运以及对免疫注射后归巢过程的示踪。

肿瘤免疫治疗通过激活患者自身的免疫系统使其获得对抗肿瘤的能力，因其独特的持久应答以及低副作用的特点已成为癌症精准医疗中的一大热点，并已逐步发展成为继手术、化疗和放疗后的第四种肿瘤治疗模式。癌症疫苗、细胞免疫治疗以及免疫检查点疗法作为免疫治疗的三种途径为癌症的治疗模式带来了革命性的变革，俨然成为当前肿瘤治疗领域的热点。一些新兴的手段可以与肿瘤免疫治疗相结合以提高治疗的效果，比如在制备癌症疫苗时，利用载体载运抗原进入细胞并进行实时监测；与传统治疗方式相结合，增加免疫检查点疗法的效率。所以，现在研究者们开始开发一些纳米载体或光敏剂以增强肿瘤免疫治疗的效果。

癌症疫苗是近年来免疫治疗研究的热点之一，其原理是将肿瘤抗原以多种形式如肿瘤细胞、肿瘤相关蛋白或多肽、表达肿瘤抗原的基因等导入患者体内，克服肿瘤引起的免疫抑制状态，增强免疫原性，激活患者自身的免疫系统，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的。而树突状细胞（DC）疫苗作为癌症疫苗的一种，它通过载运抗原进入DC使其成熟，免疫注射后通过归巢迁移至淋巴结以激活T细胞实现免疫治疗。DC作为最强的专职抗原提呈细胞，是引发肿瘤抗原强免疫应答的关键。但在生物体内DC的含量较少且功能容易受损，因此将载有肿瘤抗原的宿主DC进行体外培育，制备DC疫苗，是获得生物体免疫应答的有效手段。近几年，已经被应用在HIV和癌症的免疫治疗中。由于需要将肿瘤相关抗原载运至DC中，因此高效地将抗原载运至DC中是提高DC疫苗制备效率的关键。同时，DC疫苗若要正常激活免疫反应，则必须要待其归巢迁移至引流淋巴结与其中的T细胞相互作用。而对这一过程进行监测的传统方式—“异硫氰酸荧光素异构体(FITC)标记法”不能进行实时监测，而且需要将组织从活体淋巴结中取出，这也就意味着无法通过这种方法获得更多的信息来指导临床治疗。因此，对DC疫苗载体的需求可以分成两部分：高效载运抗原进入DC和对DC疫苗的迁移进行实时监测。

最近，范曲立团队制备了具有供体-受体-供体（D-A-D）结构的NIR-II荧光小分子染料TTQ-TF。接着利用开环聚合在其侧链修饰含有丰富阳离子的多聚赖氨酸得到TTQ-PLL，以实现对免疫治疗中常用的抗原-卵清蛋白（OVA）的高效负载。如图1所示，TTQ-PLL在水溶液中的最大吸收峰位于740 nm，在808 nm激光激发下测试得到最大发射峰位于1050 nm附近，达到了NIR-II区域，且其最大穿透深度接近6 mm。这说明TTQ-PLL是一个理想的NIR-II荧光探针，并可进一步用于活体的成像应用。

图1  TTQ-PLL在pH 7.4和5.0下的(a) 紫外-可见吸收光谱和在808 nm激光激发下的(b)荧光发射光谱; TTQ-PLL纳米粒子的(c) DLS图和(d) TEM图；(e) 不同组织深度下TTQ-PLL的NIR-II荧光图像和(f) NIR-II荧光信号强度值。 

得益于TTQ-PLL侧链上的聚赖氨酸结构带来的大量阳离子，使得其对OVA的包载率高达18.69%。同时有研究发现，适量的阳离子也利于纳米粒子进入DC细胞。而进入DC中的TTQ-PLL@OVA在其弱酸性的环境下也会加速OVA的释放。如图2所示，使用流式细胞仪对不同时间点进入DC中FITC标记的OVA进行监测，结果发现TTQ-PLL包载蛋白后的纳米粒子可以在2 h内进入DC中，而游离的蛋白则难以进入细胞。同时对TTQ-PLL@OVA的NIR-II荧光成像也证明摄取了该纳米粒子后的细胞可以被用于活体的实时荧光示踪。

图2  DC与游离的FITC-OVA (a) 和TTQ-PLL@FITC-OVA (b)培养后对FITC荧光的流式细胞分析；摄取TTQ-PLL@OVA后DC的NIR-II荧光成像图(c)和其NIR-II荧光信号强度值(d)。 

当未成熟的DC摄取OVA后会转化为具有较强抗原递呈能力的成熟DC。成熟的DC可以与T细胞结合产生大量免疫因子诱导细胞毒性T淋巴细胞的产生以清除肿瘤。实验中摄取TTQ-PLL@OVA后的DC共刺激因子（CD80和CD86）的表达水平与对照组相比有着明显的提高，同时也刺激了免疫因子的释放。因此这种具有释放免疫因子的成熟DC可以当作DC疫苗用于免疫治疗的研究。如图3所示，给小鼠通过足垫注射摄取了TTQ-PLL@OVA的DC后，对小鼠进行了NIR-II荧光成像跟踪，在24 h时发现小鼠足垫注射同侧的腹股沟淋巴结处出现荧光信号并逐渐增强。而对照组（不含OVA）的小鼠并不能观察到腹股沟淋巴结处的荧光信号。接着解剖小鼠取出淋巴结对其进行NIR-II荧光成像，结果发现注射摄取了TTQ-PLL@OVA的DC小鼠其与足垫注射同侧腹股沟淋巴结的NIR-II荧光信号要明显高于对侧以及对照组。这证明摄取了TTQ-PLL@OVA的DC可以高效的迁移至淋巴结中，因此利用TTQ-PLL的NIR-II荧光来进行归巢过程的示踪来获得更多的信息将能够为DC疫苗的研究以及未来免疫治疗在临床上的应用提供帮助。

图3  (a)评价迁移能力的足垫注射模型（红色箭头为足垫注射部位）以及活体淋巴结成像（红色圆圈区域）；离体淋巴结的NIR-II荧光成像图(b)及其NIR-II荧光信号强度值(c)。 

该项工作近期发表于Sci. China Chem.，论文第一作者为南京邮电大学博士生王超，通讯作者为孙鹏飞副教授和范曲立教授。详见：Wang C, Sun B, Bao H, Wang T, Xu W, Sun P, Fan Q, Huang W. NIR-II probe modified by poly(L-lysine) with efficient ovalbumin delivery for dendritic cell tracking. Sci. China Chem., 2020, DOI: 10.1007/s11426-020-9780-8.

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通讯作者简介
范曲立，博士生导师，“万人计划”中青年科技创新领军人才，现任南京邮电大学材料科学与工程学院院长。长期从事有机光电功能高分子、有机/无机杂化材料、生物医用材料、化学与生物传感等领域的应用基础研究，先后在多功能纳米药物载体、生物传感和纳米光学诊疗剂等方面获得了一系列创新成果。近五年来，作为通讯作者或第一作者已在Nat. Commun.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Adv. Mater.、Biomaterials等国际期刊发表SCI论文94篇。