RBM20调控心肌中一类环状RNA的形成

8月16日，循环学顶级杂志Circulation Research杂志在线发表了一项重要的环状RNA研究最新成果，该论文的通讯作者是荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心的Esther E. Creemers教授和Yigal M. Pinto教授。本文介绍发现了扩张型心肌病重要的致病基因RBM20参与调控了Titin基因一类环状RNA形成的过程(Khan et al., 2016)。

RBM20是一种RNA结合蛋白，参与调控了众多心脏特异性的基因编辑过程，其中就包括Titin基因。RBM20突变后常导致扩张型心肌病（DCM），结合最新的RNA剪接作用的新发现，尤其是由反向剪接作用形成环状RNA的相关研究报道的陆续出现，启发了作者提出了一个新的假设：RBM20突变或许会通过影响环状RNA的形成参与DCM疾病发生的过程！如果这个假设得到验证，将为DCM致病机理提高全新的研究角度。

作者选取了2个对照，2个肥厚型心肌病（HCM）和2个DCM的样本，分别进行RNA提取和测序分析。样品RNA进行核糖体RNA去除，建库分析后采用MapSplice2进行环状RNA分析。

 图1 心肌中分析环状RNA表达特征的技术流程（来自(Khan et al., 2016)）

结果表明环状RNA在人类心肌中是大量存在的，对照和疾病组呈现不同的特征。共发现了7130种环状RNA，其中826种为三组样本中均存在的。

图2心肌样本中环状RNA大量存在。（来自(Khan et al., 2016)）左：三组样本中环状RNA种类特征。右：环状RNA与所对应的线性RNA表达量不完全对应。

有趣的是，作者发现有超过80种对应于Titin基因的环状RNA分子，其中22种为三组样本中均存在的。RYR2基因也发现了59种对应的环状RNA，其中16种在三组样本中均存在。且这些环状RNA的种类，表达量与所在基因的长度，转录本长度以及线性基因的表达量都没有太大的对应关系。

图3 基因长度与环状RNA数目的关系（来自(Khan et al., 2016)）

A. 环状RNA数目与转录产物长度的对应关系分析。

B. 环状RNA数目与基因长度的对应关系分析。

目前环状RNA研究领域普遍认为更长的内含子更能增加形成环状RNA的机会。于是作者就分析了三组样本均有表达的826中环状RNA所对应的反向剪接内含子的中位长度与全基因组中内含子中位长度，结果表明这826种环状RNA对应的内含子中位长度为13071 nt，全基因组的中位内含子长度只有1727 nt。作者也分析823种环状RNA对应的内含子区反向Alu元件的情况，结果表明16%的内含子包含了成对存在的反向Alu元件，对照组中这一数值仅为7%。这些数据与其他课题组相关报道的结论基本一致。

图4 心肌中826种环状RNA内含子分析。（来自(Khan et al., 2016)）

A. 内含子长度分析。

B. 反向剪接模式图。

C. Alu元件序列。

D. Alu元件的间距分析。

作者也针对这826种环状RNA的miRNA结合状况进行了分析。以随机的编码区和3’UTR区序列作为对照，利用miRbase 结合RNAhybrid tool分析潜在的miRNA结合位点，最终表明这826种环状RNA结合miRNA的位点数目与对照序列没有明显差别。

图5 miRNA结合位点数分析。（来自(Khan et al., 2016)）

Ensembl CDS：随机抽取的编码区序列对照。Ensembl 3’UTR：随机抽取的3’UTR序列对照。

为排除假阳性的情况，作者随机抽选了22条筛选到的环状RNA进行表达量和测序验证。分别选择了Poly A-(+)和Poly A-(-)以及RNase R消化与否的对照条件进行验证，结果表明全部符合环状RNA的特征，Sanger测序结果也能证明环化形式的存在。

图6 环状RNA验证实验（来自(Khan et al., 2016)）

作者在这一步验证过程中也发现了PCR实验存在多条条带的情况。对应于一些可变剪接作用。

图7 一些环状RNA存在可变剪接形式。（来自(Khan et al., 2016)）

在826种环状RNA中，DCM中有43种表达状况与对照不同，HCM中有60种。由于RNA-Seq的实验每组只选了两个样本，作者在所选择的22个验证的环状RNA中选择其中的10个，每组扩大至7个样本，进行半定量PCR验证。

图8 HCM和DCM特异性表达差异环状RNA验证（来自(Khan et al., 2016)）

对PCR电泳条带进行定量后分析，表明cCAMKD和cTTN存在疾病特异性表达降低。cCAMKD在HCM和DCM中均下调，而cTTN只在DCM中下降。而这两个基因所对应的线性RNA表达量在三组样本中并未出现明显的变化。

图9 疾病特异性环状RNA定量分析鉴定（来自(Khan et al., 2016)）

从前面的数据中，作者鉴定到非常多的对应于Titin基因的环状RNA。Titin分子中存在一个I-band的区域，该区域是觉得肌节强度的重要位置，作者在所鉴定到的环状RNA中有一些是对应于这一区域的。之前已有报道表明RBM20参与了I-band区域相关的RNA剪接作用过程。RBM20突变会导致I-band区域剪接作用异常，影响Titin蛋白功能。于是作者就提出假设，是否在Titin对应的80种环状RNA所对应的内含子中会存在丰度更高的RBM20结合位点？结果证实了这一假设。80种环状RNA所对应的反向剪接内含子中RBM20结合位点的丰度大约是随机对照序列的5倍以上，而对应于所有826种环状RNA，RBM20结合位点的丰度大约是对照序列的2倍以上。

图 10 Titin基因对应的环状RNA （来自(Khan et al., 2016)）

作者构建了RBM20基因敲除小鼠进行验证。该小鼠模型具有典型的DCM特征。在该小鼠模型中，作者挑选了4条位于I-band区域的RBM20相关的环状RNA（mus_cTTN1-4）和2条位于N2A 和Z-disk区的不依赖RBM20的环状RNA（mus_cTTN5-6）进行半定量PCR分析，结果表明RBM20敲除后无法形成mus_cTTN1-4却不影响mus_cTTN5-6。

 
图11 RBM20敲除小鼠中RBM20结合序列对应的环状RNA无法形成。（来自(Khan et al., 2016)）

有趣的是，在RBM20敲除的小鼠中，原先对应于形成环状RNA的外显子更集中存在于线性的RNA中。作者推测可能是在Titin基因转录后的前体RNA中，这些外显子在RBM20的协助下从前体RNA分子中剪切下来，并进一步形成环状RNA，而当RBM20突变或敲除后，这些外显子序列无法正常剪切下来并形成环状RNA，最后积攒在线性的RNA分子中。

图12 RBM20敲除小鼠中RBM20依赖的环状RNA对应外显子序列积累在线性RNA分子中（来自(Khan et al., 2016)）

最后，作者在一例RBM(E913K)杂合突变的DCM病人样本中验证了RBM20相关环状RNA形成作用的情况。结果表明在该突变病人体内Titin基因I-band区对应的环状RNA形成作用受到了非常大的影响。

本文首次发现RBM20调控了一类环状RNA形成过程，或许为揭开扩张型心肌病致病机制提供了新的思路。也暗示着与RBM20有关的环状RNA分子的含量或许也可以成为这类疾病早期诊断的重要候选标志物。

参考文献：

Khan, M.A., Reckman, Y.J., Aufiero, S., van den Hoogenhof, M.M., van der Made, I., Beqqali, A., Koolbergen, D.R., Rasmussen, T.B., Van Der Velden, J., Creemers, E.E., et al. (2016). RBM20 Regulates Circular RNA Production From the Titin Gene. Circ Res.

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