人类外显子环状RNA的研究进展及其临床价值

原创 2016-09-20 句月山人 circRNA

9月2日，RNA Biology在线发表了复旦大学肿瘤研究所黄胜林教授的受邀综述文章，系统分析了人类外显子环状RNA的研究进展及其临床意义(Lyu and Huang, 2016)。作者从环状RNA的基本介绍入手，系统介绍了人类外显子环状RNA的鉴定和表达情况，主要特性，相关功能，潜在作用机制以及临床应用价值。

环状RNA的相关背景介绍：

在上世纪70年代就发现了环形RNA的存在，截至目前，共有五大类环状RNA分子：

（1）环状基因组RNA（包括类病毒和丁型肝炎病毒等）；

（2）内含子环状RNA；

（3）RNA加工过程的环状RNA中间体分子（rRNA或tRNA加工的中间体）；

（4）具有持家基因功能的环状RNA分子（例如RNase P或一些snoRNA）；

（5）外显子环状RNA (Lasda and Parker, 2014)。

很长一段时间以来，环状RNA一直被认为是错误拼接的副产物而未得到广泛重视，但随着二代测序技术的兴起，在众多物种和细胞中鉴定到了大量的环状RNA，其中不少还具有组织细胞特异性的表达特征，预示着这一类RNA分子或许拥有特殊的生物学功能。环状RNA由反向拼接所形成，遵从GU/AG的外显子剪接方式，绝大部分由mRNA前体分子形成，形成机制方面有三种模型：

（1）反向互补序列介导；

（2）套索结构驱动；

（3）RNA结合蛋白介导。

目前的研究表明环状RNA与生长发育过程及人类疾病有密切关系，例如神经系统的发育和疾病过程，癌症，心血管疾病等。环状RNA主要分布于细胞质中，也有报道发现在唾液和外泌体中存在环状RNA，提示这类分子或许是一种新型的生物标志物。

环状RNA的鉴定及其主要性质：

随着二代测序技术的兴起，人们发现了种类数目惊人的由反向剪接作用形成的环状RNA分子，它们绝大多数的含量极低，但有些环状RNA的含量甚至高于所对应的线性RNA分子。目前人类中发现了数以万计种类的环状RNA，构成了人类转录组中种类最庞大的一类产物。已有一些在线的数据库资源汇总了相关的数据资料。CirBase汇总整理了已知的环状RNA基本信息。Circ2Traits整理了与疾病和治疗相关的环状RNA。Circnet整理了环状RNA相关的表达特征及miRNA/circRNA互作网络的信息。CircInteractome是一个分析环状RNA相互作用的miRNA或蛋白的在线工具，也可以用该工具进行引物或干扰RNA设计等。CIRCpedia是一个整合性的数据库，旨在汇总环状RNA相关的可变剪接及其细胞特异性分布信息。

对目前已报道的算法（包括circRNA_finder、find_circ、 CIRCexplorer、CIRI和 MapSplice）进行了分析比较，最终结果表明CIRCexplorer 和Mapsplice是准确率和灵敏度最高的算法(Hansen et al., 2016)。但这两种算法的运算速度比较慢，且需要有基因的相关注释信息。需要强调的是，受限于算法的局限性，可能会存在未被挖掘出来的环状RNA分子，也可能存在由于分子间间接作用或基因组重组突变或者仅仅由于序列比对分析算法本身原因等造成的错误报告数据，避免这类错误的可行的选择是同步利用多种算法和信息资源进行分析。

表1 在线环状RNA研究工具和数据库

环状RNA的基本特征：

在人类成纤维细胞中，环状RNA对应的基因占到了14%左右。目前在人类样本中已发现的环状RNA超过10万种之多。绝大部分环状RNA存在于细胞质中，但有极少数定位于细胞核内。人类环状RNA长度通常小于1500nt，平均长度在500nt左右。环状RNA的环化位点两侧的内含子比平均内含子长度长，说明更长的内含子有助于形成环状RNA分子。目前已在多种物种中发现了环状RNA，说明环状RNA的形成是有进化基础的。一些环状RNA存在明显的组织和细胞特异性的表达状态。人们还在唾液和外泌体中检测到了环状RNA的存在。这些特性都提示环状RNA很可能有目前尚未知晓的重要生物学功能，有潜在的临床应用价值。

图1 人类外显子环状RNA形成机制与主要功能（来自(Lyu and Huang, 2016)）

环状RNA在发育和疾病过程中的功能：

环状RNA的一系列特殊性质引起了生物医学研究人员的广泛兴趣，目前已发现一些疾病和发育相关的环状RNA研究报道：

环状RNA与人类大脑发育及疾病的关系：一系列的研究报道表明哺乳动物的大脑组织中大量富集环状RNA分子。大脑发育过程中环状RNA的总体表达量上升，经常富集在突触结构中，与所对应的线性RNA表达特征不太一致，说明环状RNA或许起到特殊的作用。例如目前功能研究最清楚的环状RNA CDR1as在大脑中的表达和功能就非常有趣。在小鼠的大脑中，CDR1as主要在mesencephalon区（中脑的一个区域），在斑马鱼中干扰成熟型miR-7或者增加CDR1as后导致中脑发育异常，体积变小(Hansen et al., 2013; Memczak et al., 2013)。在人类Alzheimer’s Disease中CDR1as表达偏低，或许与AD疾病发生发展过程有关。

图2 CDR1as 与 miR-7在小鼠组织中表达情况（来自(Memczak et al., 2013)）

环状RNA与人类心血管疾病的关系：一些研究进展表明环状RNA与心血管疾病的关系非常密切。例如前不久Nature Communications杂志在线发表的Daniel Teupser教授的研究成果，来源于lncRNA ANRIL的环状RNA circANRIL能够通过竞争性抑制核糖体RNA前体分子结合PES1影响核糖体生成并导致核仁压力，与动脉粥样硬化疾病发生发展密切相关。

早在2010年，另一项研究表明circANRIL还可能通过调控INK4/ARF的表达参与动脉粥样硬化疾病发生发展过程(Burd et al., 2010)。另一项研究表明CDR1as与心肌梗死有关，在心肌梗死的小鼠模型中检测到了心肌组织中CDR1as过表达的现象，CDR1as过表达可能导致心肌组织细胞凋亡，过表达miR-7可缓解该过程。另一项研究中，作者发现了circ-Foxo3在组织细胞衰老中的作用，circ-Foxo3在胞质中结合ID-1、 E2F1、 FAK 及 HIF1α，影响它们参与压力相关通路的调控作用，促进衰老进程。在小鼠模型中过表达circ-Foxo3的干扰RNA显著降低心肌细胞衰老表型。而circHRCR则可通过竞争性抑制miR-223起到保护心肌的作用(Du et al., 2016)。

图3 circ-Foxo3影响细胞压力反应相关通路的机制（来自(Du et al., 2016)）

环状RNA与人类肿瘤的关系：已有不少的研究论文报道发现了一些肿瘤相关的环状RNA分子。Bachmayr-Heyda和他的同事最先发现结肠癌细胞系及癌组织相对于癌旁组织的环状RNA表达总体下降，发现环状RNA表达量与疾病进程存在负相关性关系(Bachmayr-Heyda et al., 2015)。有趣的是，有一类环状RNA是由于肿瘤相关的染色体重组后形成的，称为融合性环状RNA（fusion circRNAs，f-circRNA），目前已发现多种f-circRNA分子，包括来源于人类急性早幼粒细胞白血病（APL）病人，SK-HEP-1肉瘤细胞系以及H3122肺癌细胞系等不同肿瘤和细胞系中的f-circRNA分子( Guarnerio et al. 2016)。

文章报道了两种f-circRNA分子：f-circPR 和f-circM9在肿瘤中的作用研究，过表达它们能促进MEF细胞增殖和克隆形成能力。在有表达所对应的融合基因蛋白产物的细胞中过表达f-circM9依然可以促进细胞增殖和克隆形成能力，f-circRNA也可以增加肿瘤细胞耐受化疗药物的能力。另一方面在NB4细胞中敲低f-circPR会诱导细胞凋亡。这些研究将这一类环状RNA赋予了类似癌基因的功能，称之为癌性环状RNA （onco-circRNA）。

环状RNA也可能存在抑癌性作用，例如食管鳞状细胞癌中cir-ITCH通常为低表达状态，cir-ITCH作为miRNA sponge，能增加所对应的线性RNA ITCH的丰度。在结肠癌中cir-ITCH还可以参与调控Wnt/beta-catenin信号通路。circ-Foxo3在肿瘤细胞中也扮演了重要角色，敲低circ-Foxo3可诱导细胞凋亡。

环状RNA的其他生理病理作用：在人类细胞上皮样-间充质样转换（EMT）过程中有大约三分之一的环状RNA形成过程受到一种RNA结合蛋白Quaking（QKI）的调控，进一步的分析表明这些受QKI调控的环状RNA或许与EMT相关的细胞迁移侵袭相关的机能变化有关。另一项研究发现circular RNA100783与CD28-associated CD8(+) T衰老进程有关。竞争性结合miR-136的环状RNA与人类的软骨退化过程有关。

环状RNA的潜在作用机制：

环状RNA与RNA分子相互作用：环状RNA作为miRNA Sponge的功能模型是报道最早的环状RNA功能模型，典型的如CDR1as，该分子中包含了60多个miR-7的结合位点，在人类大脑中，每个细胞内的CDR1as可竞争性结合超过2万个miR-7分子。除了CDR1as，还有少数几个具有miRNA sponge功能的环状RNA分子，例如circSRY包含了16个miR-138的结合位点。其它如circHIPK3，circ-Foxo3包含了竞争性结合多种类型miRNA的能力。环状RNA还有可能通过竞争性结合lncRNA或者mRNA起作用，但目前还没找到直接的证据。

环状RNA与蛋白相互作用：已有的文献报道表明环状RNA可以结合RBP发挥功能，例如结合Argonaute，RNA聚合酶II及MBL等。例如circ-Foxo3可结合ID-1、 E2F1、 FAK 及 HIF1α影响后者在压力相关通路中发挥作用。circ-Foxo3还可以结合CDK2和p21蛋白形成三元复合物，抑制CDK2的功能，阻止细胞周期进程。这些研究表明circ-Foxo3似乎作为一个蛋白相互作用的脚手架，与众多的蛋白结合，影响蛋白的功能。但关于circ-Foxo3如何结合这些蛋白目前还不很清楚。

环状RNA调控RNA转录和剪接作用过程：包含内含子序列的一类环状RNA（EIciRNAs）不像传统的环状RNA定位于细胞质中，这类环状RNA定位于细胞核内，通常在启动子区富集，可通过U1结合RNA聚合酶II，促进所对应的RNA转录作用。环状RNA是前体RNA加工的产物与所对应的线性RNA存在相互竞争抑制的可能性。例如MBL基因第二外显子形成的环状RNA circMBL便是这样的，在该基因的第二内含子中含有MBL的结合位点，能促进circMBL的形成。

环状RNA翻译多肽或蛋白：早期的体外研究表明在环状RNA分子中增加IRES元件可以导致其翻译蛋白。最近的一系列研究表明在人类细胞中存在一种不依赖5’帽子结构的蛋白翻译机制，也为环状RNA表达多肽提供了可能的机制。但目前尚未有直接的证据表明内源性环状RNA可翻译蛋白。

人类环状RNA的临床意义：

环状RNA不包含游离的5’和3’末端，具有相对更高的稳定性，因此是作为疾病或生理过程的标志物的理想选择。例如一些疾病相关的染色体易位导致的f-circRNAs仅能在发生染色体易位之后才可检测到。比如circ_101222在先兆性子痫的病人血液中明显增高。将血浆蛋白因子endoglin (ENG) 的检测联合circ_101222检测进行疾病早期诊断，可得到灵敏度0.7073，特异性0.8049的先兆性子痫诊断准确性效果。结肠癌患者与健康对照组相比血液外泌体中的外显子环状RNA丰度有较明显的差异(Zhang et al., 2016)。

环状RNA的检测也成功应用于胃癌的预测。在卵巢上皮癌中，相对于健康对照组，环状RNA相对于线性RNA的表达情况明显改变。一些环状RNA已报道可作为一些疾病的标志物，例如喉癌中hsa_circRNA_100855 和 hsa_circRNA_104912，肝细胞癌中hsa_circ_0001649，结肠癌中circRNA_001569和 hsa_circ_001988。此外，环状RNA还可以作为疾病治疗的靶点，例如circ-Foxo3作为治疗靶点，有望应用于心肌梗死或一些肿瘤的治疗中。

图4 circ_101222联合ENG检测大大提高先兆性子痫疾病预测准确性（来自(Zhang et al., 2016)）

环状RNA还有很多的未解之谜，包括它们的形成，转运和降解机制等。从目前的研究进展来看，环状RNA发挥功能的方式是多样化的，类似于lncRNA。环状RNA在疾病诊断和治疗中也显示出了特殊的价值，是一个尚未完全开发的巨大资源宝库。

致谢：该微信文章写作过程中得到原文作者黄胜林教授的悉心修改和指导，在此表示衷心感谢！

参考文献：
Dongbin Lyu, Shenglin Huang. The emerging role and clinical implication of human exonic circular RNA. RNA Biol. 2016 Sep 2:0. [Epub ahead of print].

近期热文

环状RNA在神经系统发育和疾病中的作用

2
RBM20调控心肌中一类环状RNA的形成 3