单细胞测序表明单细胞circRNA表达状态呈现高度异质性
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最近，PLoS One在线发表了圣犹达儿童医学研究院Charles Gawad教授团队的一项研究成果，探索了ASXL1基因环状RNA表达特征，用到了单细胞测序技术进行环状RNA和线性RNA表达状态的分析，结果表明单细胞中环状RNA等表达状态呈现高度的异质性特征(Koh et al., 2016)。
本文专门针对ASXL1基因的环状RNA表达情况进行探索分析，属于典型的针对特定基因的环状RNA表达和功能的研究课题，这也将成为未来环状RNA的重要研究趋势之一。ASXL1基因属于Polycomb家族，在髓系白血病中经常出现基因突变，从CircBase数据库中能找到一个在小鼠和人中保守存在的环状RNA记录（CircBase ID hsa_circ_0001136），对应于ASXL1基因的外显子2和3。
本文作者首先通过RNase R消化和PCR扩增验证CircBase数据库中记录的环状RNA，但实验中发现有另一条条带，回收该条带后测序发现是另一种环状RNA，携带了全新的外显子序列，作者称之为exon 3*，该外显子位于内含子3中。
为进一步探讨环状RNA形成机制，作者构建了模拟体系，将ASXL1基因的短链形式（Short Form）克隆后在Hela细胞中表达，分析外显子3与外显子4或者反向地与外显子2拼接的比例（克隆片段示意图如下）。作者同时也构建了删除5’UTR以及CMV启动子的突变体。从定量RT-PCR的结果来看，环状RNA的含量与外源过表达的线性RNA呈现一定的对应关系，当线性RNA无法表达时（CMV启动子删除突变），环状RNA也对应的下降。而针对存在于第一内含子的另一个转录起始原件的删除突变（5’UTR删除突变体），环状RNA仍可以继续表达。因此作者得出结论，ASXL1基因的环状RNA是从线性的RNA转录前体分子形成的。
图2 ASXL1基因环状RNA形成于线性转录前体分子 （来自(Koh et al., 2016)）
之前也有多篇文章报道存在于内含子的反向互补RNA序列元件（例如Alu序列）是形成环状RNA的重要前提条件。作者也分析了ASXL1基因的内含子序列，并构建了各种形式的删除突变体，结果证实反向的Alu序列是形成环状RNA 的必要条件。
图3 反向Alu序列时ASXL1基因环状RNA形成的重要条件 （来自(Koh et al., 2016)）
作者接下来借助高通量测序技术深入分析了各种RNA剪切产物的表达特征。作者在所构建的过表达细胞中进行深度测序，作者从中还发现了一些特殊的RNA拼接产物，比如外显子1与3*甚至外显子4的拼接产物。在外显子1与其他外显子拼接的产物中，作者也发现了一些非常奇怪的拼接产物，比如1-2-4（跳过外显子3）、1-2-3*-4（外显子3换成了3*）等等。这些发现也表明RNA拼接是一个高度复杂多样的过程。
图4 ASXL1基因不同剪切产物表达特征系统分析 （来自(Koh et al., 2016)）
深度测序的结果是细胞群体中的结果，在单细胞中表达状况是怎样的呢？作者接下来利用单细胞测序进行分析，结果表明在单细胞中ASXL1基因的环状和线性RNA表达呈现非常明显的异质性特征，个别细胞甚至没有相关RNA的表达，各种RNA拼接产物的含量也千差万别。
图5 单细胞测序表明ASXL1基因外显子剪切作用呈现单细胞水平的高度异质性特征（来自(Koh et al., 2016)）
总之，从本文的结果来看，RNA拼接过程包括环状RNA形成过程是一个高度复杂多样的过程，单细胞水平呈现高度异质性。本文的研究相对比较粗略，没有太深入的机制研究，但将单细胞测序技术应用于环状RNA的研究还是挺有价值的，也为各位同行的感兴趣的问题提供了新的技术参照。
参考文献：
Koh, W., Gonzalez, V., Natarajan, S., Carter, R., Brown, P.O., and Gawad, C. (2016). Dynamic ASXL1 Exon Skipping and Alternative Circular Splicing in Single Human Cells. PloS one 11, e0164085.
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