circRNA在实体瘤中的功能和临床意义的长篇综述

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声 明

苏州大学医学院附属第三医院的吴昌平教授在Journal of Hematology & Oncology（IF=7.333）杂志在线发表了题为“Function and clinical significance of circRNAs in solid tumors”的关于circRNA在实体瘤的功能和临床意义的长篇综述。具体阐述了circRNA的特点、生物形成、功能和其与不同实体瘤的关系，同时也介绍了相关circRNA的研究策略。

1979年，洛克菲勒大学的Hsu和Coca-Prados第一次发现circRNA存在真核细胞的胞浆中。之后的几十年里，circRNA一直被认为是剪切错误的产物。circRNA是一类不同于线性mRNA的普遍存在的、稳定的、保守的非编码RNA，因为它没有5’ 端帽子和3’端polyA尾，而且经常在不同组织和组织中特异性表达。随着RNA-seq技术和生物信息学的发展，大量的circRNAs被研究人员发现。circRNAs主要有四种类型，分别为只含有外显子的ecircRNA、只含有内含子的ciRNA、同时含有外显子和内含子的EIciRNA和intergenic circRNA。

1. circRNA的特点

1) 丰富性和多样性: 真核细胞目前已发现了超过20000种circRNAs;

2) 稳定性: circRNAs的半衰期很长，因为它没有5’ 端帽子和3’端polyA尾，不容易为外切酶降解，导致其的稳定性远远大于mRNA的；

3) 保守性：circRNAs中的一些序列在许多物种中都是保守的，如人、小鼠、线虫、斑马鱼、果蝇、原生生物和植物等；

4) 定位特异性：大多数circRNAs是属于ecircRNA，主要定位于胞浆；而含有内含子的ciRNA 和 EIciRNA，主要定位于真核细胞的核内；

5) 表达特异性：circRNAs经常会特异性表达在不同的组织和不同的发育阶段。

2. ecircRNAs和EIciRNAs的形成机制

a) 内含子配对引起的环化反应：内含子侧翼含有反向重复或者ALU原件会引起碱基配对，通过切除内含子获得ecircRNAs，最后保留部分内含子获得EIciRNAs；

b) 套索引起的环化反应：即通过外显子跳跃获得ecircRNAs和EIciRNAs。外显子的5’端攻击3’端剪切位点，形成含有跳跃的2号和3号外显子的RNA套索与含有1号和4号外显子的mRNA，接着再形成EIciRNA和双RNA套索的两种产物；

c) 依赖RBPs形成circRNA的方式：RBPs结合到内含子上下游的序列motif上，作为桥梁拉近侧翼内含子的距离，以形成circRNA。

3. introns和intergenic circRNAs形成circRNAs的机制

a) ciRNA的形成：pre-mRNA可被剪切为含有2’,5’—磷酸二酯的RNA套索，然后切除3’尾巴后形成ciRNA；

b) 剪切的I型内含子形成circRNA：外源性鸟苷攻击内含子的5’端，通过转酯反应切除1号外显子；游离1号外显子的3’端羟基攻击2号外显子的5’端，形成线性内含子；靠近线性内含子3’端的2’羟基攻击5’端的磷酸二酯键，导致含有2’,5’—磷酸二酯的RNA套索形成和释放5’端的序列；最后切除RNA套索的3’尾巴，形成I型内含子的circRNA;

c) 剪切的II型内含子形成circRNA：pre-mRN释放2号外显子，内含子3’端的2’羟基攻击5’端的磷酸二酯键，产生含有2’,5’—磷酸二酯的RNA套索和游离的1号外显子；

d) 内含子包含片段（ICFs）侧翼的GT-AG剪切信号作为剪切供体和剪切受体，以环化连接形成intergenic circRNAs。

4. circRNA的功能

a. 作为miRNA的sponge，通过碱基互补配对原则竞争性结合miRNA，吸附不同的miRNA，影响miRNA所靶向基因的表达；b.参与 RNAP II延伸；c. 参与可变性剪切；d. 参与翻译调节；e. 作为蛋白骨架；f. 有助于蛋白定位；g. 可作为翻译的模板；h. 参与组蛋白修饰；i. 促进RNA的成熟

5. circRNA与不同实体瘤的关系

据报道，越来越多种circRNA参与许多肿瘤类型的发生发展，通过对肿瘤组织和癌旁正常组织的circRNA表达谱差异分析，发现某些circRNA在肿瘤中的表达水平上调或者下调，从而促进或者抑制肿瘤的生长，并且很有可能发展成为肿瘤治疗和预后的生物标志物。本篇综述总结了118篇关于circRNA对实体瘤影响的研究论文，包括9例肺癌、14例乳腺癌、3例食管鳞癌、20例胃癌、17例结直肠癌、16例肝癌、10例神经胶质瘤、7例膀胱癌、4例胰腺癌、5例骨肉瘤和14例其他类型肿瘤（2例卵巢癌、1例肾癌、1例甲状腺癌、1例基底细胞癌、1例皮肤鳞癌、2例口腔鳞状细胞癌、1例喉部鳞状细胞癌、1例下咽癌、2例胆管癌、1例宫颈癌和1例前列腺癌）。作者对研究论文中的每种肿瘤中涉及到的circRNAs种类、编码基因、推测的功能、差异表达水平、是否为miRNA的sponge、影响到的信号通路和对于的参考文献，都分别给予了详细的总结和介绍，让阅读这篇综述的研究者，更好地了解在不同肿瘤中哪几种circRNAs发挥了重要作用与其功能，也可以给专门研究某种肿瘤的研究者提供了研究方向。

6. 研究circRNA的方法和技术

RNA-seq和基因芯片可用于检测肿瘤中的新circRNAs；RT-qPCR、micro-drop digital PCR、Northern Blotting和FISH技术可用于验证相关疾病相关的circRNA表达水平；过表达和敲低circRNAs验证其在癌细胞增殖和凋亡中的功能；生物信息学预测、荧光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀法、RNA pull-down实验联合MS质谱检测分析可用于揭示circRNA与miRNA 、circRNA和蛋白的相互结合；生物信息学分析circRNAs中的M6A、IRES和ORF元件，研究其蛋白编码能力；核糖体印记、核糖体IP、m6A IP、Western blotting和质谱都被广泛用于circRNA的验证实验。当然还有许多circRNA相关的数据库，如circBase, CircInteractome, CircNet和 Circ2Traits，提供研究人员查询circRNAs的基本信息和潜在的调控网络。

7. circRNA的临床应用前景

由于circRNAs的多样性与肿瘤类型、恶性程度的不一样，有些circRNA可以促进肿瘤的发展，而另一些circRNA可以抑制肿瘤增殖、生长，所以circRNA可以是治疗靶点，也可以成为治疗载体。对于一些致癌性的circRNAs，可以利用siRNAs抑制circRNA的表达，而不会干扰正常基因的mRNA的表达；对于一些抑癌性的circRNAs，采取诱导circRNAs表达的基因疗法治疗肿瘤。另外，circRNAs具有高度稳定性和吸附miRNAs与某些蛋白的特点，提示circRNAs有可能作为运输载体，或者具有特异的结合位点，结合致癌性miRNAs和蛋白质，从而达到抑制肿瘤生长的目的。在精准医学方面，根据不同癌细胞类型和不同阶段的细胞，设计细胞特异性启动子，限定circRNAs在某种细胞的时空表达；或者对circRNAs与miRNAs、蛋白的结合位点进行增强修饰，增强circRNAs与两者的结合能力，更大发挥抑制致癌性miRNAs和蛋白的功能，进而抑制肿瘤的生长。因为circRNAs有可能作为蛋白翻译的模板，可设计可以表达肿瘤抑制蛋白的circRNAs，进一步将circRNAs转化为有效治疗肿瘤的手段。

参考文献

1. Geng Y, Jiang J, Wu C. Function and clinical significance of circRNAs in solid tumors. J Hematol Oncol. 2018 Jul 31;11(1):98. doi: 10.1186/s13045-018-0643-z.

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