荐读 | circFAT1(e2) 作为胃癌发生的抑制分子

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声 明

来自苏州大学第一附属医院高凌的研究团队最近于Cancer Letters (IF=6.491)发表了一篇题为“A novel circular RNA, circFAT1(e2), inhibits gastric cancer progression by

targeting miR-548g in the cytoplasm and interacting with YBX1 in the nucleus”的研究，首次发现了新型circFAT1(e2)作为胃癌发生的肿瘤抑制因子，circFAT1(e2)在胃癌细胞的胞浆和胞核均有分布，处于胞浆的circFAT1(e2)可以sponge miR-548g，上调RUNX1的表达，从而抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭；处于胞核的circFAT1(e2)直接结合YBX1，下调YBX1的表达，抑制胃癌的发生发展。

1. 挖掘胃癌相关的新型circRNA

通过GEO数据库检索关键字后，随机挑选了两个数据集（GSE100170 和 GSE83521），两个数据集都有前250名表达差异明显的circRNA，其中只有两种circRNA(hsa_circ_0067997 和 hsa-circ_0001461)是在两个数据集中同时表达下调的，RT-PCR检测只有hsa_circ_0001461在胃癌细胞株中均有表达，则选择其为后续研究的对象。因为hsa_circ_0001461来源于FAT1基因的2号外显子，故命名为circFAT1(e2)。体外RT-PCR证明了只有在利用反向引物PCR该基因的cDNA时检测到circFAT1(e2)，Sanger测序也证明了其来源于基因的2号外显子；FISH实验证明了circFAT1(e2)位于胞浆和胞核；放线菌素D和RNase R处理证明了其属于环状结构，不同于线性mRNA。

2. circFAT1(e2)的表达水平与临床胃癌的相关性

相比于正常组织，胃癌组织中circFAT1(e2)的表达水平明显下调，而且相比于不发生转移的胃癌组织，发生转移的胃癌组织中circFAT1(e2)的表达水平明显下调；相比于正常为组织细胞，六种胃癌细胞株中circFAT1(e2)的表达水平也明显下调；FISH实验也证明了同样的结果；临床数据分析显示，circFAT1(e2)的表达水平与性别和年龄无关，而与pN、pM状态和临床分期有关。

3. 过表达circFAT1(e2)抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

构建circFAT1(e2)过表达载体，转染到胃癌细胞MGC-803和 MKN-28中，验证其过表达情况；MTT实验证明过表达circFAT1(e2)可以明显抑制细胞的增殖；克隆形成实验证明过表达circFAT1(e2)可以明显抑制细胞克隆团形成的数目；transwell实验证明过表达circFAT1(e2)可以明显抑制细胞的迁移和侵袭能力。体内成瘤实验证明过表达circFAT1(e2)的胃癌细胞在体内成瘤能力明显下降。

4. 胞浆的circFAT1(e2)直接结合miR-548g，上调RUNX1的表达

RT-PCR和FISH实验证明circFAT1(e2)有55%定位于胞浆，45%定位于胞核；很多时候定位在胞浆的circRNA通过靶向miRNA发挥其功能，作者通过TargetScan预测了miR-548g与circFAT1(e2)有5个结合位点；荧光素酶报告基因实验证明了两者确实存在结合作用，而miR-548g抑制剂可以抑制这种结合作用；RIP实验利用miR-548g特异性探针也可以捕获到circFAT1(e2)，而且miR-548g探针只能结合胞浆的circFAT1(e2)；为进一步明确circFAT1(e2)与 miR-548g的表达相关性，过表达circFAT1(e2)可以下调miR-548g的表达水平，而敲低circFAT1(e2)表达可以上调miR-548g的表达水平；同时在6种胃癌细胞株中也证实了circFAT1(e2) 和miR-548g表达的负相关性，这些结果提示circFAT1(e2) 可以负调控miR-548g的表达水平。

5. miR-548g通过调控RUNX1促进胃癌发生

生物信息学分析显示miR-548g与RUNX1 的3’ UTR存在3个结合位点，荧光素酶报告基因实验证实了两者的相互结合作用；过表达circFAT1(e2)上调了细胞中RUNX1的表达水平，敲低circFAT1(e2)表达会下调了细胞中RUNX1的表达水平，而不会影响到RUNX2、3蛋白的表达水平。但是如果同时添加miR-548g mimics处理，circFAT1(e2)正向调控RUNX1表达的效应会被miR-548g所抑制，这提示circFAT1(e2)通过结合miR-548g，正向调控RUNX1的表达。另外，过表达RUNX1诱导细胞增殖、迁移和侵袭能力下降的效应都会被miR-548g所抑制，这进一步说明miR-548g通过RUNX1促进胃癌细胞的致癌性。

6. 胞核的circFAT1(e2)直接结合YBX1 

由于之前的FISH结果显示circFAT1(e2)还会分布在胞核，为进一步研究其在胞核发挥的功能，作者利用在线catRAPID算法，预测了多种蛋白能与circFAT1(e2)结合，其中YBX1的结合评分最高。将circFAT1(e2)序列分为四部分(a, 1-1000; b, 1001-2000; c, 2001-3000; d, 3001-3283)，利用算法预测每部分与YBX1的结合能力，其中a和d部分的结合评分最高；RIP实验利用YBX1抗体捕获到了YBX1和circFAT1(e2)的表达；通过体外合成circFAT1(e2)序列的四部分，用来检测pulldown YBX1的能力，同样证明了a和d部分结合YBX1的能力最强。

7. circFAT1(e2)通过YBX1抑制胃癌细胞的致癌性

RT-PC实验发现过表达circFAT1(e2)可以明显下调YBX1的三种靶基因(EGFP, c-Met和 CDC25A)的表达，而YBX1可以抑制该效应；同时YBX1可以抑制过表达circFAT1(e2)后诱导细胞增殖、迁移和侵袭能力下降的效应，这提示circFAT1(e2)通过YBX1抑制胃癌细胞的增殖。

参考文献

1. Fang J, et al. A novel circular RNA, circFAT1(e2), inhibits gastric cancer progression by

targeting miR-548g in the cytoplasm and interacting with YBX1 in the nucleus. Cancer Lett. 2018 Nov 9;442:222-232. doi: 10.1016/j.canlet.2018.10.040.

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