深度长文『下』|2019年度circRNA研究盘点

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circRNA研究工具与方法进展

2019年circRNA取得了骄人的成绩，也涌现出一批新的circRNA研究技术方法和工具，这一部分我们将梳理一下这方面的主要进展。

4.1  circRNA研究新技术方法

靶向circRNA分子的高通量shRNA文库技术

2019年4月26日，Cell杂志发表了加拿大多伦多大学Paul C. Boutros教授和Housheng Hansen He教授为共同通讯作者的circRNA研究工作，通过大样本测序和高通量shRNA文库筛选对局限性前列腺癌生长必须的circRNA （essential circRNA）。作者首先通过对144对前列腺癌/癌旁配对标本进行深度测序，分析得出前列腺癌特异性的circRNA，挑选表达丰度靠前的2000个circRNA设计shRNA，为减少脱靶效应带来的假阳性结果的干扰，作者在这些circRNA所对应的mRNA中也设计了对照shRNA。最终所获得的shRNA共靶向1507种circRNA和对应来源基因的1075种mRNA的shRNA文库。经过负选择筛选分析，最终获得了171种前列腺癌相关的essential circRNA分子（[16]）。

图34 高通量shRNA文库筛选前列腺癌essential circRNA （[16]）

circRNA敲除体系

2019年1月15日，Nature Immunology在线发表了中国科学院生物物理研究所田勇教授和范祖森教授为共同通讯作者的文章，介绍发现来自Pan3基因的环状RNA circPan3在IL-13调控的肠道干细胞自我更新过程中发挥重要调控作用。文章构建了circPan3的敲除模型。小鼠中不存在Alu序列，促进circRNA形成的往往是一些SINE元件，因此作者需要首先确认需要打靶的circRNA是由什么序列介导形成circRNA的。作者的策略是在小鼠的Lgr5+ISCs细胞中通过慢病毒载体构建mini-gene，模拟体内成环的过程。基于这一技术路线，可以通过构建删除特定内含子片段分析介导所感兴趣的circRNA由哪些序列元件介导的。作者就是通过这种技术路线找出了介导circPan3生成的内含子序列，如下图中a所示的#1和#2位置，Northern杂交也证明了删除#2的mini-gene不再表达circPan3。有了这个基础才能设计出专门针对circPan3的敲除方案，作者设计了靶向#2位置的打靶体系，最终获得了准确删除该位点的小鼠，经过鉴定，该小鼠中circPan3被准确敲除，与此同时，Pan3基因的其他转录产物（下图f中靠上侧的一坨）没有受到明显的影响，Pan3蛋白也没有明显的变化（[39]）。

图35 circPan3敲除模型构建策略（[39]）

基于环状RNA高效表达核酸适配体

2019年4月8日， Nature Biotechnology在线发表了洛克菲勒大学Samie R. Jaffrey教授为通讯作者的文章，报道开发一种基于circRNA高效表达核酸适配体（aptamer）的技术体系。该环状RNA表达体系被命名为“Tornado”， 该技术是基于具有自剪切功能的核酶（Ribosome）实现待环化序列的上下游切割，环化作用则借助于内源的RNA连接酶RtcB实现，最终的产物包含了待环化序列以及为实现环化而携带的Ligated stem序列（racRNA） （[40]）。Tornado环状RNA过表达体系具有自动剪切，自动环化，表达高效且可实现适体体内过表达的优点，为环状RNA的过表达开辟了新途径。

图36 Tornado环状RNA过表达载体 （[40]）

改良的基于RNase R富集circRNA技术

2019年9月19日，Nucleic Acids Res杂志发表了一种circRNA富集纯化技术的文章，报道一种改良的基于RNase R富集circRNA的技术方法。该研究中，作者证明涉及RNase R的标准方案> 20％高表达的线性RNA不能消化，但这些缺点可以在很大程度上克服。具有高度结构化的3'末端的RNA（包括snRNA和组蛋白mRNA）天然地对RNase R具有抗性，但是一旦将poly（A）尾添加到其末端，就可以有效降解。此外，RNase R在许多多腺苷酸化mRNA的体内停滞，特别是在以前注释为G-四链体（G4）结构的富含G的序列中。在用反应缓冲液中的Li +代替K +（其稳定G4s）后，作者发现RNase R能够将这些序列进行并完全降解mRNA。该研究的结果为目前用于分离环状RNA的方法提供了重要的改进，以及揭示可以天然抑制细胞核酸外切酶降解RNA结构的方法（[41]）。文章的通讯作者是美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Jeremy E. Wilusz。

图37 改良的基于RNase R富集circRNA技术 （[41]）

4.2  circRNA研究的信息学工具与数据库

CircSplice新工具全面挖掘癌症特异性circRNA选择性剪切事件

2019年3月8日，Molecular Cancer杂志在线发表了武汉大学何春江教授团队开发了一种全新的从头算法工具CircSplice，它可以识别circRNA中的内部选择性剪接，并比较不同条件之间的差异circRNA剪接事件。通过CircSplice对透明细胞肾细胞癌和膀胱癌数据挖掘后，分别在两个数据集中检测到4498和2977个circRNA可变剪接（circ-AS）事件，并通过RT-PCR证实了circ-AS事件的表达。研究者进一步检查了癌症和邻近正常组织中circ-AS的分布和模式，为了进一步了解癌症特异性circ-AS的潜在功能，将这些剪切事件分类为肿瘤抑制因子和癌基因，进行了信号通路富集分析。该研究开发的工具可首次全面了解癌症特异性circRNA选择性剪接，对癌症中circRNA的调控和功能研究有重要贡献（[42]）。

该工具网址链接

http://gb.whu.edu.cn/CircSplice

或

https://github.com/ GeneFeng / CircSplice

图38 CircSplice支持鉴定四种circRNA可变剪切事件类型 （[42]）

circAtlas: 多物种circRNA表达数据库

2019年3月19日，Cell Reports杂志发表了中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员团队的一项研究成果，利用高通量测序技术对人、猴和小鼠的44个正常组织进行转录组评估，鉴定出大量circRNA分子，并重建72.6%的circRNA全长序列，为circRNA的可变剪切、保守性以及与线性RNA的关系研究提供了重要数据资源。该研究成果已汇总到circAtlas数据库中。circAtlas数据库提供界面友好的数据检索和呈现方式，包括了多项circRNA资源，如circRNA及其宿主基因在各组织中表达值，miRNA和RBP（RNA结合蛋白）预测信息；circRNA在人、猴、小鼠、大鼠、猪、鸡和狗7物种中保守性；circRNA蛋白翻译相关的ORF和IRES信息；文献报道疾病相关的circRNA收录等信息（[43]）。

图39 circAtlas数据库 （[43]）

Ularcirc：circRNA分析及可视化工具

2019年11月18日，在线发表了澳大利亚张任谦心脏研究所David T. Humphreys为通讯作者的文章，报道Ularcirc工具。该文献作者开发的Ularcirc的软件工具，它集成了识别反向剪接位点和正向剪接位点的可视化功能，并能对鉴定的circRNA进行下游分析。Ularcirc可利用CIRI、circExplorer或STAR比对软件的原始输出结果，组装环状RNA的反向剪接位点（BSJ）计数表，并允许多样本分析。研究者使用Ularcirc工具分别从公共和内部生成的数据集中识别和表征circRNA，并演示了它如何用于(i)发现新的亲本转录本剪接模式，(ii)检测circRNA的内部剪接模式，(iii)以及揭示反向剪接位点（BSJ）形成的复杂性。此外，该研究还确定了circRNA可能具有比亲本转录本线性序列更长的开放阅读框。最后，我们检测并验证了由ApoA4转录本产生的一类新型环状circRNA的存在，其反向剪接位点（BSJ）来自编码外显子内的多个非经典剪接位点（[44]）。

图40 Ularcirc工具集工作流程（[44]）

环状RNA在约1000种人癌细胞系中的综合表征研究

2019年8月26日，Genome Medicine杂志发表了德州大学休斯敦健康科学中心韩冷教授团队的一项工作，报道分析了超过1000种人类癌症细胞系中circRNA表达分析的结果。人癌细胞系是癌症研究和开发治疗策略的基本模型。然而，目前在许多癌细胞系中并没有表征环状RNA（circRNA）的数据。该研究中，研究者对CCLE（Cancer Cell Line Encyclopedia，癌症细胞系百科全书）数据库中的RNA-seq数据，应用四种circRNA识别算法分析了约1000种人癌细胞系中circRNA的表达谱特征，还综合分析探索不同癌症谱系中circRNA的表达情况，生物形成，细胞功能和药物反应等。研究结果揭示了circRNA在不同癌症细胞中具有高度特异性表达模式，表明circRNA可能是癌症治疗中强有力的诊断或预后标志物。研究者还通过实验鉴定了涉及circRNA生物形成的关键基因，证实TGF-β信号通路在该过程中起到重要作用。更引人注目的是，研究者发现一些癌症临床上常见基因上富集RNA结合蛋白（RBP），更可能产生circRNA。其中，circMYC可促进细胞增殖。我们观察到circRNA的表达与药物反应之间的强烈关联，特别是那些靶向染色质组蛋白乙酰化的药物。同时，该研究还开发了一个癌细胞系circRNA数据库——CircRiC（https：//hanlab.uth.edu/cRic），该数据库目前包含了来自CCLE的22个癌症谱系中935个癌细胞系中circRNA的表达特征、生物形成、药物应答和整合分析等数据，对circRNA研究提供了非常有意义的参考（[45]）。

图41 circRic数据库主页 （[45]）

NPInter v4.0：非编码RNA互作数据库

2019年10月31日，Nucleic Acids Res发表了更新版的NPInter v4.0数据库，文章的通讯作者是中国科学院生物物理研究所陈润生院士，何顺民研究员和中国科学院计算技术研究所赵屹研究员。非编码RNA（ncRNA）在多种生物信号通路中起着至关重要的调控作用。已有研究表明非编码RNA可以与蛋白、RNA以及基因组相互作用，调控复杂生物过程。陈润生院士课题组早在2006年发布了NPInter数据库，近日该数据库已更新至第4版，NPInter（NPInter v4.0)数据库系统地收录了绝大多数种类非编码RNA（新增circRNA）的相互作用，并对相互作用以及相关分子进行了详细的注释以及可视化，提供了一个全面、系统的非编码RNA相互作用的研究平台。环状RNA（circRNA）的相互作用和ChIRP-seq获得的非编码RNA-基因组的相互作用首次被收录进来。总数据量上升到11万条，涵盖了35个物种。相互作用以及作用分子还增加了疾病注释，可帮助研究者更好地理解相互作用的功能。除了整合数据之外，整个数据库的网站也进行了重新构建，提高了原有搜索模块的易用性（[46]）。

数据库网址为

http://bigdata.ibp.ac.cn/npinter4

图42 NPInter v4.0数据库首页 （[46]）

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非医学相关circRNA研究进展

非医学相关的circRNA研究总体体量比较小，受众面也比较窄，常见的研究主要基于表达谱分析和基于miRNA的互作网络预测分析，因此选择下面这个工作作为代表进行介绍。

EpCAM敲除小鼠circRNA表达谱分析

2019年7月8日，International Journal of Molecular Medicine杂志在线发表了中科院广州生物医药与健康研究院赖良学教授和广东中医药大学广东省中西医结合代谢病研究中心郭姣教授为共同通讯作者的文章，报道分析了EpCAM敲除老鼠中circRNA的表达状态。作者利用Cas-9技术构建了EpCAM敲除老鼠，并分析了肝脏中非编码RNA的表达情。测序的结果显示11个上调和12个下调的circRNA（[47]）。

图43 EpCAM敲除老鼠肝脏circRNA表达分析 （[47]）

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circRNA重要综述

Nature Reviews Genetics：circRNA的生成和特征

2019年8月8日，Nature Reviews Genetics发表了一篇circRNA的综述文章，系统回顾介绍了circRNA研究的主要进展，包括circRNA的形成，检测方法，主要功能机制，主要研究技术等。文章的通讯作者是丹麦奥胡斯大学的Lasse S. Kristensen，其中著名circRNA研究专家Jørgen Kjems教授是本文的共同作者。

图44 目前检测和定量circRNA的主要技术列表（[48]）

EMBO Journal：circRNA的过去，现在和将来

2019年7月25日，美国Brandeis大学生物系的Sebastian Kadener等人在EMBO Journal杂志上在线发表了circRNA的综述，回顾了circRNA的研究历程，主要进展和将来的发展趋势 （[49]）。

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circRNA研究总体趋势与未解决的问题汇总分析

2019年circRNA延续了迅猛的发展态势，在发表论文总数目，尤其是大于10分的高质量论文数目出现了巨大的增长，国家自然科学基金的项目数也维持了去年的水平。circRNA虽然已经有了多年的研究，但依然有若干重要的问题没有得到有效解决，概括而言，包括如下问题：

（1）circRNA组织/疾病特异性表达的机制；circRNA的组织/疾病特异性表达特征已经有了一定的认知，但产生这种特异性的机制的认识还非常有限。

（2）泛组织circRNA表达谱分析；目前绝大部分研究工作均聚焦于特定组织或疾病标本中的表达分析，但从一些泛组织/疾病表达谱分析的结果来看，组织特异性的表达特征认识还比较局限，因此这方面的工作依然需要加强，尤其是同步分析不同组织间的表达差异。

（3）敲除技术和基因改造动物模型问题；circRNA的敲除是非常有挑战性的工作，目前也仅有少数几篇文章用到了敲除模型，但从回答circRNA的生理/病理意义的角度而言，敲除模型是非常重要的科学证据，因此未来针对特定circRNA分子的敲除模型可能会越来越多。

（4）circRNA精确的亚细胞定位和活细胞成像观测；生物分子的亚细胞定位是决定其功能和互作分子的一个重要特征。目前对circRNA的亚细胞定位认识非常有限，这方面的研究几乎刚刚起步的状态。

（5）circRNA二级结构分析与动力学研究；结构是决定功能的关键，circRNA的二级结构的研究一直比较有限，2019年陈玲玲教授和杨力教授的Cell文章就是发现了circRNA一种特殊的结构状态，并发现它们与自身免疫效应通路的关系。未来有关circRNA二级/高级结构及分子动力学的研究将是重要的发展方向。

（6）circRNA修饰谱分析；目前circRNA中仅有m6A修饰的文章报道，但RNA中有多达150种的修饰方式，绝大部分的研究依然非常有限，因此有关circRNA的修饰谱将是非常有潜力的研究方向。

（7）同一circRNA分子不同机制的研究；circRNA研究发展到今天，很多的研究都聚焦于同一个circRNA分子，因此关于同一个分子在不同组织或疾病中的功能机制将是circRNA接下来研究的重要方向，相互作用蛋白，转录后修饰以及是否可以翻译都是值得思考的功能机制方向。

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