Molecular Cancer | circHER2翻译产物是三阴乳腺癌新靶点

环状RNA具有与miRNA和蛋白竞争性结合、直接翻译蛋白和多肽等诸多功能。然而，至今对环状RNA翻译的多肽和蛋白功能的研究仍然较少，因此环状RNA的翻译也成为近年来的研究热点。2020年9月11日，中山大学附属第一医院张弩教授在Molecular Cancer（IF=15.302）发表文章（1），解析了一种新的HER2来源的环状RNA circ-HER2，circ-HER2约在30%的三阴性乳腺癌细胞中表达，其可以翻译出的多肽HER2–103可以促进三阴性乳腺癌细胞的增殖和侵袭，而且 HER2–103还可以作为抗HER2靶向药物帕妥珠单抗（Pertuzumab）的靶标分子。这一发现为一些三阴性乳腺癌病人提供了新的治疗靶点，对临床上三阴型乳腺癌患者的治疗具有重要意义。

研究背景

三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中一种特殊的类型，缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）以及受体络氨酸激酶HER2的表达。相比于受体阳性或HER2阳性的乳腺癌，TNBC侵袭性强、发病年龄早、转移能力强、复发率高、总体生存率低，临床表现更为严重。然而至今对其的治疗仍然依赖于化疗，效果较差。因此，寻找针对TNBC有效的靶向治疗手段对于提高TNBC患者的疗效至关重要。

Circ-HER2的筛选与验证

为了筛选新的环状RNA，作者首先将临床上的5个三阴性乳腺癌（TNBC）样品及其对应的正常组织同时进行高通量环状RNA测序和传统RNA测序，筛选出1200个差异变化环状RNA（图1A，在TNBC中613个上调，587个下调）以及1609个差异变化线性编码基因（图1B，在TNBC中721个上调，888个下调）。KEGG分析表明RNA-seq中的差异变化编码基因富集在PI3K-Akt pathway, Focal adhesion，Transcriptional mis-regulation in cancers等信号通路，与先前报道的TNBC中显著激活的信号通路一致（图1C）。随后，作者将circRNA测序和RNA测序的结果进行交叉匹配，为了寻找那些具有独立功能的circRNAs，作者将目光集中在环状RNA显著差异表达但其对应的母基因的mRNA表达变化无差异的环状RNA中，最终从中筛选出909个环状RNA（图1D）。为了减少范围，作者首先选择出130个测序中超过10个接头位点reads以及具有circBase注释的环状RNA，将这些环状RNA与13132个编码基因一起进行WGCNA调控网络分析，发现至少10个与乳腺癌相关的hub基因，其中5个环状RNA与这10个hub基因高度关联，其中就包含circ-HER2 (hsa_circ_0007766)。随后作者通过设计divergent引物PCR并测序、干扰和过表达后的northern blot分析、RNase R消化后的qPCR检测、FISH实验证明了Circ-HER2的确存在，且在细胞中表达并主要定位在胞质内（图1E-I）。

图1  Circ-HER2的筛选与验证

Circ-HER2在部分TNBC中富集

确认了circ-HER2的存在后，作者对其在不同乳腺癌细胞内的表达情况进行研究。发现在HER2表达阳性的乳腺癌细胞BT474和SK-BR-3中circ-HER2也高表达，而在TNBC细胞中，circ-HER2在MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞中高表达，而在MDA-MB-453和BT549细胞中没有表达。对于Luminal型肿瘤细胞，如MCF7和T47D中，circ-HER2的表达与MCF10A相似均低表达（图2A）。对于临床样品的研究同样发现在23个HER2阳性的乳腺癌病人，circ-HER2均高表达（图2B），而在59个TNBC病人中，仅30.5（18/59）病人的癌组织circ-HER2高表达（图2C），而且circ-HER2高表达的患者明显治疗效果更差（图2E）。

图2  Circ-HER2在部分TNBC中富集

Circ-HER2编码HER2–103

为了进一步研究circ-HER2的功能，作者首先研究了Circ-HER2是否能够翻译。通过蔗糖梯度密度离心后的多聚核糖体分析（图3A）、双荧光素酶实验对核糖体进入位点（IRES）的活性验证、Flag标签标记（图3C）、制备特异性抗体检测（图3E）、免疫共沉淀-质谱分析（IP-MS）（图3F）这一系列实验证明了circ-HER2可以翻译出一个由103个氨基酸组成的多肽HER2–103。同时作者也对HER2–103的序列特征进行解析，发现HER2–103肽段几乎与HER2蛋白的胞外结构域CR1相同，仅少了图3B中蓝色部分的少量氨基酸。同样的，作者也验证了HER2–103在不同乳腺癌细胞中的表达，与circ-HER2的表达一致，所有HER2阳性细胞均表达HER2–103，部分TNBC细胞系表达HER2–103，Luminal型肿瘤细胞均不表达HER2–103（图3G）。在临床样品中，41%（5/12）的TNBC癌组织表达HER2–103（图3H），也与其部分表达的结果一致。通过mCherry标记HER2–103发现HER2–103主要定位在细胞膜附近并可以分泌出细胞（图3I）。

图3  Circ-HER2可以翻译为一个103氨基酸长度的蛋白HER2–103

HER2–103可以促进TNBC细胞的增殖和侵袭

为了验证circ-HER2/HER2–103的功能，作者构建了circ-HER2过表达和干扰稳转细胞株，发现HER2-103的缺失降低了MDAMB-231和MDA-MB-468细胞增殖能力，而过表达HER2-103则促进了BT549细胞的增殖（图4A）。同时体外的细胞侵袭能力实验也证明HER2-103的表达与细胞的侵袭能力正相关（图4B-D）。最后，小鼠体内接种实验同样也证实HER2–103促进肿瘤发生和侵袭的作用（图4E）。

图4  HER2–103对TNBC细胞的增殖和迁移十分重要

HER2–103促进TNBC中EGFR/HER3的聚合和激活

既然清楚了HER2–103促进TNBC细胞的增殖和侵袭的作用，那HER2–103行使作用的具体机制又是什么呢？为了解决这一问题，作者将目光集中在与TNBC恶性化相关的EGFR（HER1）和HER3上，它们可以激活下游AKT通路进而保持肿瘤细胞的增殖。结果发现在MDAMB-231和MDA-MB-468细胞中，干扰HER2–103的表达可以降低EGFR和EGFR/HER3磷酸化水平并抑制下游AKT通路的激活（图5A），相反的，在BT549细胞中，HER2–103的过表达则提高了EGFR的激活水平从而加强下游AKT通路的激活水平（图5B）。进一步研究发现HER2–103可以通过其与HER2蛋白相似的CR I位点与EGFR（氨基酸位点165-310）和HER3（位点166-328）直接的相互作用诱导EGFR/HER3或EGFR/EGFR的二聚化，进而提升下游的AKT通路促进肿瘤细胞增殖（图5C-G）。而且在HER2阳性的乳腺癌细胞中，HER2–103也可以与HER2结合，促进HER2的磷酸化和二聚化。

图5  HER2–103促进TNBC中EGFR/HER3的相互作用和激活

表达HER2–103的TNBC对帕妥珠单抗（Pertuzumab）敏感

上述的研究结果表明约在30%的三阴性乳腺癌患者中，虽然HER2不表达，但HER2-103的表达仍能激活下游AKT信号通路进而促进肿瘤的增殖，因此HER2-103作为一个决定这些肿瘤细胞增殖的关键因素，就很有可能作为一个特异的靶点用以治疗部分三阴性乳腺癌患者。由于HER2-103几乎与HER2 CR I位点氨基酸序列一致，因此作者首先猜想靶标HER2 CR I位点的靶向药物帕妥珠单抗是否也对HER2-103同样有效呢？不出所料，小鼠皮下接种MDA-MB-231和MDA-MB-468后用帕妥珠单抗处理确实能够显著减小两种肿瘤细胞的生长，免疫组化染色也证实帕妥珠单抗显著的抑制了EGFR/Akt信号的激活以及MDA-MB-231和MDA-MB-468肿瘤细胞向肺部侵袭的能力。

图6  表达HER2–103的TNBC对Pertuzumab敏感

总结

本文利用经典的环状RNA的研究方法，即从高通量测序的方法筛选得到目标环状RNA circ-HER2，确认circ-HER2的存在和表达模式以及翻译能力，最后进行功能验证。这一系列细致完整的实验证明了circ-HER2翻译的多肽HER2-103在约30%的三阴性乳腺癌样本中高表达并且能够促进肿瘤细胞增殖和侵袭，这让HER2-103成为一个潜在的三阴性乳腺癌特异治疗靶点。幸运的是，由于HER2-103的翻译的多肽与HER2蛋白的CRI结构域序列基本一致，利用抗HER2蛋白CR I结构域的靶向抗体帕妥珠单抗也可以特异性的靶向HER2-103，降低其表达水平，进而抑制肿瘤的发生和侵袭。这一发现为部分三阴性乳腺癌的治疗提供了新的可能，在临床上具有重要意义。

参考文献

1. Li, J., Ma, M., Yang, X. et al. Circular HER2 RNA positive triple negative breast cancer is sensitive to Pertuzumab. Mol Cancer 19, 142 (2020). https://doi.org/10.1186/s12943-020-01259-6.

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