表观遗传学研究利器 | ATAC-seq的技术原理及应用

ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing)是一种利用Tn5转座酶研究染色质可进入性（可接近性）的高通量测序技术。ATAC-seq是新型的表观遗传学研究利器，该技术通过Tn5转座酶对某种特定状态下开放的核染色质区域进行切割，进而获得在该特定状态下基因组中所有活跃转录的调控序列。在表观遗传学领域具有广阔的发展前景。

染色质可接近性

染色质是由DNA缠绕着核小体构成。核小体是由H3、H4、H2A和H2B四种组蛋白构成的八聚物，每个核小体上大约含有146 bp的DNA。染色质分为常染色质和异染色质，在结构上常染色质折叠压缩程度低，处于伸展状态。DNA复制和基因转录时，DNA的致密高级结构变为松散状态，这部分无核小体包裹的裸露DNA区域被称为开放染色质（open chromatin）。染色质一旦被打开，就允许一些调控蛋白，比如转录因子和辅因子与之相结合，染色质的这种特性叫做染色质的可接近性（chromatin accessibility），又叫染色质的可进入性。这一特性反映了染色质转录活跃程度。特定条件下的染色质开放性变化可以提供大量的基因表达调控信息。

染色质开放性是动态的不是静止的，整体的调控过程与染色质核小体的动态定位相关，因此，高效精确地定位基因组上的开放染色质位点、知晓核小体位置的动态变化，为成功发掘基因组调控元件，以及揭示基因表达调控机制提供重要线索和有效手段。在医学领域，染色质的开放性研究技术是研究重大疾病发病机制、药物作用机制、新药研发和生物标志物功能等的新一代有力武器。来自斯坦福大学医学院的研究人员为探究小细胞肺癌的转移机制，联合 ATAC-seq、ChIP-seq与 RNA-seq 对肺原发癌和肝脏转移癌进行比较分析，发现Nfib通过广泛提高染色质的可接近性促进了癌症转移[1]。ATAC-seq 还被应用于绘制人类原发性肿瘤[2]、急性髓系白血病[3]、黄斑病[4]等疾病的染色质可接近性图谱。这些研究探索了基因调控的相互作用，揭示了驱动疾病发生和发展的调控突变，推动了复杂疾病在表观遗传水平的研究。

图1：染色质的开放区和闭合区对调控蛋白的结合力不同

如何分析哪个区域的染色质是开放的？

目前基因组中常见的分析染色质开放性的技术方有ChIP-seq、DNase-Seq、MNase-Seq、FAIRE-seq和ATAC-seq。这些检测方法主要通过酶解或者化学方法来分离可接近的或者受保护的区域DNA序列，分离得到的DNA再用二代测序的方法进行量化，以用于研究基因组开放区。

染色质免疫共沉淀技术（chromatin immunoprecipitation，ChIP）与二代测序相结合的ChIP-seq技术，能够高效的在全基因组范围内检测与组蛋白修饰、转录因子等相互作用的DNA序列。但一次测序只能检测细胞中数百个处于活跃状态转录因子中的一个，检出效率低。

Epigenetics ＆ chromatin, 2014, 7(1): 33.

图2：染色质开放区4种研究方法的比较

常用染色质开放可及性分析技术

MNase-Seq——鉴定核小体区域

微球菌核酸酶（microccocal nuclease, MNase）是一种限制性外切酶，进行片段化处理时，将DNA切成缺口后，逐个切除“裸露”的DNA，直到获得被核小体包裹或者被转录因子绑定的区域为止。主要用来鉴定核小体区域。

DNase-Seq——用DNase I 识别开放染色质区域

DNase I是一种核酸内切酶，也无法切割被核小体或者其他蛋白保护的DNA片段。利用DNaseI优先切割核小体被取代的DNA序列，对生成的片段进行测序，被用于检测特定转录因子的结合位点，但该技术对细胞起始量的要求较高，一般细胞数量要达到1×10的6次方-10的7次方，并且实验准备时间较长，需要2-3天。

FAIRE-seq——噪音高的检测技术

FAIRE（Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements）甲醛辅助分离调控元件，是用甲醛对染色体中裸露的DNA进行固定，通过细胞裂解与超声打断再进行酚氯仿抽提获取水相中的DNA。在酚氯仿抽提的过程中，裸露的DNA溶于水相中，核小体-DNA复合物留在两相界面。实验准备时间3-4天。

以上的这些研究染色质开放区的方法都有明显的不足，涉及多个实验流程，操作复杂，需要大量的细胞，实验周期长且重复性差等。

为了解决这些问题，2013年，美国Stanford大学的William Greenleaf教授研发了一种全新的方法，利用DNA转座酶结合高通量测序技术，来研究染色质的可进入性，即ATAC-seq。ATAC-seq 是利用转座酶研究染色质可进入性的高通量测序技术。其原理是利用Tn5转座酶可切割开放染色质区域的特性，对捕获到的DNA序列进行测序。DNA转座，是一种把DNA序列从染色体的一个区域搬运到另外一个区域的现象，由DNA转座酶来实现。这种转座插入DNA，也是需要插入位点的染色质是开放的，否则就会被高级结构给卡住。

转座酶可以随机结合并切割染色质开放区的DNA，并且可同时在切割位点插入接头序列。如下图，只要将携带已知DNA序列标签的转座复合物（即带红色和蓝色序列标签的Tn5转座酶）加入到细胞核中一起孵育，再利用已知序列标签进行PCR扩增即可形成文库，经过测序就可以获得染色质开放区的信息。

Nature Methods, 2013, 10(12): 1213-1218.

图3：ATAC-seq的原理图

ATAC-seq的优势

其一：所需的样本量少。可低至数百个细胞甚至更低的细胞量即可满足建库，更加适用于珍贵稀少的样本，且ATAC-seq无片段选择性，所以这种方法可以同时获得染色质开放区域、转录因子的结合位点、核小体的调控区域和染色质状态等信息。

其二：样本准备周期短。相比于其他方法需要进行复杂的样本准备，ATAC-seq样本准备简单快捷，从而减少了长时间操作不当导致的样本的不稳定。

当然，ATAC-seq也需要严谨精确的实验准备，尤其在细胞核提取方面，实验难度依然很大，特别是针对不同的物种需要不同的提核方法，所以，ATAC-seq的数据依然非常宝贵，非常利于发表高分文章。

Nature Methods, 2013, 10(12): 1213-1218.

图4：三种基因组可接近性检测方法的建库起始量和准备时间的比较

ATAC-seq助力表观遗传学研究

通过ATAC-seq可以获得丰富的表观遗传信息，包括开放染色质图谱、核小体定位、转录因子结合位点，并通过鉴定染色质开放区域中转录因子结合位点，分析得到转录因子及调控区域。ATAC-seq可以应用于以下的这些领域：

1） 染色体开放性图谱绘制

2） 胚胎发育表观遗传修饰

3） 疾病潜在标志物的预测

4） 肿瘤发生表观机制研究

5） 肿瘤分型与微环境研究

具体的相关文献，我们后续会有相应的文章进行解读，敬请关注。

因此，ATAC-Seq由于所需细胞量少，实验简单，可以在全基因组范围内检测染色质的开放状态，目前已经成为研究染色质开放性的首选技术方法。那么，ATAC-Seq的样本需要如何准备，ATAC-Seq可以做哪些生信分析，以及ATAC-seq文章的应用思路，请大家继续关注我们后续的文章。

参考文献

1. Denny SK, Yang D, Chuang CH, et al. Nfib Promotes Metastasis through a Widespread Increase in Chromatin Accessibility[J]. Cell, 2016, 166(2): 328-342.

2. Corces MR, Granja JM, Shams S, et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science, 2018, 362(6413).

3. Tak YG, Farnham PJ. Making sense of GWAS: using epigenomics and genome engineering to understand the functional relevance of SNPs in non-coding regions of the human genome. Epigenetics Chromatin, 2015, 8(1): 57.

4. Wang J, Zibetti C, Shang P, et al. ATAC-Seq analysis reveals a widespread decrease of chromatin accessibility in age-related macular degeneration. Nat Commun, 2018, 9(1): 1364.

5. Buenrostro J D, Giresi P G, Zaba L C, et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position[J]. Nature Methods, 2013, 10(12): 1213-1218.

6. Tsompana M, Buck M J. Chromatin accessibility: a window into the genome[J]. Epigenetics chromatin, 2014, 7(1): 33.

7. Wu Jingyi, Huang Bo, Chen He, et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature, 2016, 534(7609): 652-7.

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