非经典环状RNA | 环状分子研究新的突破口？

相信大家对环状RNA的历史、生命周期、生物学功能以及研究方法都有一定的了解。

还不清楚的可以移步

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微信好文：重磅综述 | 环状RNA的调控机制和细胞功能 

特别地，虽然 2020 年全球遭受了巨大的灾难，然而环状RNA的研究却从未止步，更可以说是成绩斐然。环状RNA机制与功能研究中，ceRNA的研究数量仍占绝大多数，当下翻译蛋白潜能以及 m6A 的加持可谓是炙手可热；另外，线粒体以及病毒环状 RNA 也成为了今年新晋热点。

然而，不知道大家有没有注意到一种现象：

环状 RNA研究主要集中到了外显子环状 RNA（exonic circRNA）的研究。

但在系统性研究环状RNA之初，我们还发现了其他种类的环状分子

1. 套索形成的内含子环状 RNA （lariat derived intronic circRNA）

2. 内含子环（intron circle）

3. 部分内含子环（sub-exonic circRNA）

4. tRNA 内含子环（tricRNA）

5. tricRNA 

......

可以相信，每一个种类的环状 RNA 都应该有自己非常精彩的故事，但为何现在研究目标都集中到了 exonic circRNA 呢？

主要原因可能包括：

1. exonic circRNA 表达量相对丰富

2. exonic circRNA 有相当一部分定位在细胞质中，相对来说更容易研究，例如套用 ceRNA 机制

3. 其他种类环状 RNA 用当前测序方式难以捕获到信号

在 exonic circRNA 研究越来越成熟的情况下，这些非经典的环状 RNA 分子的研究却屈指可数，那么这些分子的生物学机制和功能到底是什么呢？能不能像今年的线粒体或病毒环状 RNA 成为新的热点呢？

下面我们就从目前仅有的一些研究窥探一下非经典环状 RNA 的秘密。

外显子环状 RNA (exonic circRNA)

当前一些研究表明，来自经典剪切位点的环状 RNA 的生物合成主要依赖于经典的剪切机制，当 pre-mRNA 加工变缓时可能有利于反向剪切通路的生物合成。反向剪切（back splicing）成环现在主要由：

1. 侧翼序列的重复元件（例如 Alu）碱基互补配对

2. RBP （例如 QKI，FUS）形成二聚物

两种方式介导（如下图）

图 1  外显子环的生物起源

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非经典环状 RNA | lariat derived intronic circRNA

什么是 lariat derived intronic circRNA

一般情况下，pre-mRNA 加工过程中会形成内含子套索（lariat）——以2'-5'磷酸二脂键连接的结构（请参考下图），内含子套索会很快被套索脱支酶（debranching enzyme）以及外显子酶（exonuclease）降解掉。

图 2  磷酸二脂键图解

然而，一些内含子却具有逃脱降解的本领。

1. 一般常规的分支点（branch point）是 A，然而逃脱的套索主要是 C（有时也可能是其他碱基）—— 可能导致套索脱支酶无法水解 2'-5' 共价键（如下图所示）。

图 3  分支点碱基

2. 5' 剪切位点邻接序列包含 7nt GU 富集的 motif 以及分支点附近 11-nt C 富集（如下图所示）。

 图 4  lariat derived intronic circRNA 来源

而这些套索进一步剪切形成环状，即 lariat derived intronic circRNA。

其他特征

1. 数量少，已有的哺乳动物研究发现不到 200 个

2. 长度短，平均长度 280nt

3. 对 RNase R 处理敏感

4. 在现有测序体系中，表达丰度被低估

目前已有的研究

由于套索 lariat 有一定的研究基础，lariat derived intronic circRNA 是非经典环状RNA中研究相对比较多的，但具体到点的研究也只有 5 篇。

1. Zhang, et.al.Circular intronic long noncoding RNAs. Mol. Cell 2013

2. Talhouarne, et.al. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of vertebrate cells. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 2018

3. Robic,et.al. Analysis of pig transcriptomes suggests a global regulation mechanism enabling temporary bursts of circular RNAs. RNA Biol. 2019

4. Saini, et.al. Free circular introns with an unusual branchpoint in neuronal projections. Elife 2019

5. Das, et.al. Identification and Characterization of Circular Intronic RNAs Derived from Insulin Gene. Int. J. Mol.Sci. 2020

功能

目前发现一些分子可以调控来源基因线性 RNA 分子的表达，例如：

1. ANKRD52 的转录被自身一个内含子产生的 lariat-derived intronic circRNA 正向调控，另外这些作者发现一些 lariat derived intronic circRNA 与磷酸化的 Pol II 紧密相关，如果去除这些 circRNA 将导致来源基因转录的显著减少(zhang et al.)

2. Ins2 来源的 lariat derived intronic circRNA 表达减少会抑制 Ins2 mRNA 的表达大(Das et al.)

或者相比来源线性 RNA 分子具有更高的表达。

1. Talhouarne et al. 发现lariat derived intronic circRNA 或 intron circles 存在时，其来源基因的线性 mRNA 消失了。

2. 在猪发育睾丸中，Robic et al.研究发现 ATXN2L 来源的 lariat derive d intronic circRNA 表达比线性分子高 2-40 倍，然而没发现环状 RNA 对线性 RNA 表达调控的证据。

亚细胞定位

zhang et al. 认为 lariat derived or intron circle 主要在核内，而 Talhouarne et al. 的研究者表示一些也可能出现在细胞质中发挥转录后调控。

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非经典环状 RNA | intron circle

这类分子就是我们常说的内含子环状 RNA，来源于整段内含子（lariat derived intronic circRNA 的 3' 末端一般离内含子末端大约 9-40 nt —— 这一段属于分支序列），并且以 3'-5' 连接。

相比 lariat derived intronic circRNA，intron circle 序列更长，但数量更少。

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非经典环状 RNA | sub-exonic circRNA

部分外显子环状 RNA，这类 circRNA 可能主要来自单外显子的非编码基因（例如 ribozyme-RNA, snoRNA, snRNA, misc-RNA 以及 rRNA），这类基因没有内含子序列，不需要剪切；另外，似乎还没发现某个但外显子基因既能产生经典的 exonic circRNA 又能产生 sub-exonic circRNA。

特别的，猪的单外显子基因 RNase_MRP 被发现能够产生 sub-exonic circRNA（Robic et al.），另外单外显子的人类同源基因 RMRP 也被发现能够产生一些环状分子（Liu et al.）。

目前并没有发现这类 circRNA 所扮演的生物学角色。

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非经典环状 RNA | 其他种类

其他种类的环状 RNA 主要来自一些 tRNA 或 rRNA，例如：

1. Lu et al. 2015 发现一些包含内含子的 tRNA 产生环状 RNA，即 tRNA intronic circular(tricRNA)

2. Danan et al. 2020 研究的环状 RNA 来自古生菌 tRNA, rRNA，C/D box RNA

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如何检测非经典环状 RNA

目前测序协议以及生信工具更适合用于 exonic circRNA 检测，另外，一些intron circles 也能被较好的识别。

检测非经典环状 RNA 仍有些其他困难：

1. 检测工具一般会对剪切信号进行过滤，可能将非经典环状 RNA junction reads 过滤掉

 —— 去除所有比对到外显子环状 RNA 的 reads 再进一步识别非经典环状 RNA

2. lariat derived intronic circRNA 2'-5' 连接方式可能让环状分子形成较复杂的结构，让反转录酶无法接近

 —— 控制反转录温度为 65°

3. 像 lariat circle 具有 7-nt GU 富集也可能造成 Illumia 测序困难

4. 一些环状分子，例如 lariat derived intronic circRNA 对 RNase R 敏感

 —— 建议用 poly A(-) 建库

5. 非经典 RNA 通常比较短，一般 < 150nt 基本上就都是非经典环了

 —— 控制号文库大小

目前可能的工具包括：

1. CIRCexplorer2（能专门识别 lariat derived intronic circRNA）

2. lariat reads identification

3. 非经典 circRNA 识别1 & 2

4. circFinder（内含子环状 RNA 识别）

总结

我们可以看到，非经典环状 RNA 的研究非常有限，也不像经典的 exonic circRNA 那样比较容易检测，然而有一点比较明确，它们绝大多数都包含非编码序列。

“曲径通幽处，禅房花木深”，想要解开非经典环状 RNA 在生命活动中所扮演的角色，仍需付出更多的努力。目前已经有不少研究团队着手于此，谁知道它们是不是环状 RNA 研究的下一个热点呢？

参考文献

1. Robic A, Kühn C. Beyond Back Splicing, a Still Poorly Explored World: Non-Canonical Circular RNAs[J]. Genes, 2020, 11(9): 1111.

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