小鼠保种方式与技巧

导语

随着近年来CRISPR/Cas9的火热及强大的基因编辑功能，科学家们利用基因编辑技术在大小鼠上面的运用也越来越多。在最近2个月，我们也一直在学习基因编辑鼠的构建，相信大家也了解到如果顺利构建一只基因敲除鼠也需要4-6个月，可见操作的繁琐和周期的冗长。那么如何简单快捷地将这些基因型小鼠长期保存呢？不着急，下面就跟着小编一起来学学如何保种。

基因种质资源的保存主要采取冷冻的方式，可以冷冻精子、胚胎、附睾、卵巢等，目前冷冻精子和胚胎比较常见。其中，冷冻保存大小鼠的精子和胚胎与单纯饲养活体动物保存种质资源相比，可以大大降低饲养动物所占用的经费、时间和空间，同时可避免饲养过程中基因的丢失。

C57BL／6J小鼠为近交系小鼠，具有遗传信息稳定等特点，近年来，基因工程小鼠多以C57BL／6J 小鼠为遗传背景。现以小鼠为例介绍下C57BL／6J小鼠的精子冻存和胚胎冻存。

小鼠精子冻存主要步骤：

1. 脱颈椎处死10-12w雄鼠，无菌取出其附睾；

2. 将附睾放入1ml小鼠精子冻存液中，剪碎附睾，使精子充分游离出来。

   
   游离的精子示意图

3. 取出脉管，将含有精子的冻存液吸入脉管，封闭脉管两端，贴上标示有基因型的标签；

4. 将脉管放在液氮蒸汽中预冷冻10min后投入液氮，可长期保存精子。

小鼠胚胎冻存主要步骤

1. 取4-5w雌鼠，下午1-2点腹腔注射5.0 IU（国际单位）的PMSG（孕马血清促性腺激素），48h后注射5.0 IU的HCG（人绒毛膜促性腺激素）。将注射过HCG的雌鼠和10-12w雄鼠合笼；

2. 次日早晨，检查雌鼠是否有阴栓，处死有阴栓的雌鼠，取输卵管，用DPBS清洗血渍；

3. 将输卵管放入透明质酸酶中，挑出输卵管膨大处的“云雾团”，几分钟后“云雾团”脱掉颗粒细胞，将胚胎挑出，用M2培养液清洗干净，放入KSOM培养液培养待用；

4. 下午3点之后，在倒置显微镜下将显现有原核的胚胎挑出，用于冻存；

5. 将20个胚胎放入低浓度冻存液中脱水3min，然后将胚胎放入高浓度冻存液中脱水1min；

6. 然后将胚胎连同高浓度冻存液吸入脉管，封闭两端，把脉管放于液氮蒸汽中预冷冻1min后，投入液氮，可长期保存胚胎。

注意事项：

小鼠精子冻存时，待精子充分游离出来后，在倒置显微镜下观察精子活力，若活力太差就没有冻存的必要了，因为冻存本身就会降低精子的活力，活力太低影响复苏和体外受精。

小鼠胚胎冻存时脱水时间都很短，所以要求技术娴熟，时间太长会导致胚胎死亡。冷冻好的精子和胚胎可以在液氮中长期保存，当需要某个基因型时可以将精子复苏做体外受精，也可以复苏胚胎直接移植入假孕鼠体内，这可以较快的获得该基因工程鼠，大大缩短制作时间，人工成本上也可大大降低。

精彩内容列表（持续更新，蓝色代表已经发表，黑色待发表）

2. 模式动物系列（二）基因编辑鼠

2.7  小鼠保种方式（精子、胚胎冻存）

2.8  小鼠体外受精介绍

3. 模式动物系列（三）疾病动物模型

长按下方二维码，可关注我们

（微信ID）bioraylab

邦耀实验室关注国内外生命科学最新动态，发布原创评论，分享实验技巧。

欢迎个人转发朋友圈，公众号、报刊等转发请联系下面邮箱授权。

[e-mail]