中山大学李攻科教授 Chem. Sci.：循环化学发光，快速手性分析新策略！

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手性是自然界的本质属性之一，自然界及生命体中蕴藏着大量的手性分子。发展快速手性分析方法对分析化学、有机化学、药物化学和生物化学等领域研究具有重要意义，已成为富有挑战性和前沿性的研究课题之一。

中山大学化学学院李攻科团队报道了一种全新的、基于液相循环化学发光的快速手性分析新策略。该策略仅采用一种手性主体分子便可鉴别多种手性客体分子的构型，且不受手性客体分子浓度影响。循环化学发光可鉴别一些核磁和荧光方法所不能鉴别的手性体系，同时该策略不需要手性分离和标准曲线直接实现对映体过量（Enantiomeric excess，ee）的快速测定。本文作者将此策略应用于 Walden 转化反应监测和手性药物测定，获得了满意结果。

相关工作以前沿论文 (Edge article) 的形式发表在英国皇家化学会旗舰期刊  Chemical Science 上。

研究背景

手性对映体具有极相似的物理和化学性质，手性分析一直是分析化学的研究难点和热点。光学传感方法，如：圆二色谱法、荧光光谱法、比色法，由于具有快速、简单及经济等优点，近年来手性光学传感器引起了研究人员的广泛兴趣。然而，手性光学传感方法面临着手性基底受限、鉴别对象范围窄，且区分效果受分析物浓度影响等问题。

化学发光（Chemiluminiscence，CL）是一种重要的光谱分析方法，特别是流动注射与化学发光联用（流动注射化学发光，FI-CL）提高了 CL 分析的重现性和自动化程度，在药物分析、临床分析和生命分析等领域得到广泛应用。然而，在 FI-CL 分析系统中，分析物或反应试剂被注入一个连续的、单向移动的载流中，然后在检测池中混合产生 CL 信号。此方法仅能检测到检测池中产生的 CL 信号，但载流的推动力会使分析物或反应试剂快速流经检测池，而 FI-CL 分析系统的载流是单向流动的，大量物质未得到充分反应便离开了检测池。因此， FI-CL 只能检测到相当于整个反应的一部分信号，可根据发光强度进行定量分析，而难于区分鉴别反应物。针对以上问题，中山大学李攻科团队提出循了环化学发光（Cyclic chemiluminescence， CCL）新概念。有别与 FI-CL，CCL 分析系统通过泵阀控制实现载流方向的自动化、周期性改变，使 CL 反应在样品注入后随着载流循环次数的增加得以周期性进行，系统检测记录一系列化学发光信号。该团队首先以纳米材料表面进行的催化发光反应为模型，以挥发性有机物为代表性分析物，探讨 CCL 新方法的应用。研究发现，CCL 动力学曲线上的峰信号满足指数衰减规律：

其中，In 为第 n 阶段反应的 CL 强度；I0 为背景噪音；t 为时间，单位为秒；A 为初始量，其物理化学意义为最大 CL 强度；τ 为寿命，代表 CL 信号衰减 1/e 倍初始量所需的时间，单位为秒。Τ 值越大表示 CL 信号衰减回背景值的速率越慢。研究表明：每一 CL 反应均有描述其信号变化规律的指数方程，可通过指数方程参数的变化来描述反应条件对 CL 反应的影响。指数方程的初变量与反应物浓度成正比，而 τ 值是与反应物浓度无关的特征常数，因此可根据上方方程进行定性及定量分析。采用该方法鉴别包括烷烃、醇类、酮类、醛类、脂类及醚类在内的 28 种有机物进，结果表明：根据 τ 值的不同有效实现了同系物和结构异构体的区分鉴别（Anal. Chem. 2014, 86, 6080−6087.）。

▲	图 1. 在 CCL 系统中诱导发生基于纳米材料的催化发光反应，一次进样可检测到呈一级指数衰减的系列信号，随着循环次数的增加，信号以一定速率衰减至背景值。（Anal. Chem. 2014, 86, 6080−6087.）

同时，CCL 一次进样可获得系列发光信号，提供了有关反应物丰富的分析信息，采用线性判别分析或借助条形码技术可提高辨别能力，实现了不同厂家的白酒、啤酒、爽肤水等复杂样品的鉴别（Anal. Chem. 2019, 91, 12063−12069.）

▲	图 2. CCL 鉴别复杂气味样品原理示意图。（Anal. Chem. 2019, 91, 12063−12069.）

CCL 作为一种新的化学发光分析技术，对复杂样品展现出强大的辨别能力，他们在气相 CCL 研究的基础上，开展了液相 CCL 研究并探索其在快速手性分析中的应用。

本篇论文

本文作者通过固定化鲁米诺方法将 CCL 扩展至液相体系，并选用鲁米诺 –H₂O₂ –金属配合物反应体系为模型，探索液相 CCL 的应用。研究中采用 3 对 6 种手性金属配合物作为主体，手性主体与手性客体通过分子间相互作用生成新的加成物，不同构型的手性主体与手性客体通过分子间相互作用生成结构不同的加成物。鲁米诺 - H₂O₂ 反应在加成物的催化作用下产生化学发光信号。经 CCL 检测得到系列呈指数衰减的发光信号。每一手性主体-客体体系的 CCL 信号均有相对应的 τ 值。手性主体一定时，不同构型的手性客体分子 τ 值具有可辨性。根据 τ 值，仅采用一种手性主体可鉴别多种手性客体，如手性醇、手性胺和手性酸。通过多种手性主体组成传感器阵列，可进一步提高方法的区分能力和可区分对象。

▲	图 3. 液相循环化学发光快速辨别手性分子原理示意图

▲	图 4. 研究采用的手性金属配合物结构式

同时，液相 CCL 策略无需手性分离及建立标准曲线，实现了 ee 值的快速测定，并成功地实现 Walden 转化反应监测及手性药物的测定。识别机理研究表明，手性主-客体通过分子间手性-手性作用生成了空间结构有差异性的加合物，这些加合物对鲁米诺 - H₂O₂ 反应的催化活性不同，使 CCL 信号的寿命不同。

该研究为快速手性分析提供了全新方法，在不对称合成反应监测和手性药物分析等领域具有良好的应用前景。推动了化学发光研究的发展，并为研究主-客体分子相互作用提供了潜在技术支持。

图文解读

本文作者首先使用 R1 和 S1 两种手性主体鉴别 1-苯基乙醇对映体。结果表明 CCL 动力学曲线的 τ 值与体系中的手性主体和客体的构型有关。当主体构型固定时，τ 值取决于客体构型，而与客体浓度无关，根据 τ 值鉴别构型。与基于信号强度增强或淬灭的其它光学传感方法不同，CCL 用于区分手性对映体的参数是与分析物浓度无关的常数，避免了浓度变化对区分效果的影响。

▲	图 5.（a）以 R1 为主体测定苯基乙醇对映体获得的 CCL 动力学曲线；（b）以 S1 为主体测定苯基乙醇对映体获得的 CCL 动力学曲线；（c）以 R1 为主体，苯基乙醇对映体浓度与体系 τ 值的关系；（d）以 R1 为主体，苯基乙醇对映体浓度与体系 τ 值的关系。

随后，本文作者以 3 对 6 种手性金属配合物作为主体，鉴别了 6 对 12 种手性客体。每一手性主-客体体系均有一特征 τ 值，不同手性主体对同一手性客体的 τ 值不同；同一手性主体对不同手性客体的 τ 值亦不同。根据 τ 值可辨别多对手性对映体，包括手性醇、手性胺和手性酸。

▲	图 6. 不同手性主-客体体系的 τ 值

虽然使用一种手性主体，CCL 可辨别多对手性对映体，但某些手性化合物的 τ 值仍较接近。本文作者将不同的手性主体组成传感器阵列，用于辨别不同浓度的 12 种手性化合物。将 τ 值转化为热图可视化，每一种手性化合物在传感器阵列上均产生了独特的多维响应图案，且不同浓度的同种手性化合物响应图案相似。采用线性判别模型处理数据，得到聚类良好的散点图，准确度为 100%。因此，基于 CCL 原理的传感器阵列可区分多种手性化合物。

进一步研究发现：CCL 可区分某些荧光和核磁方法所不能区分的手性主-客体体系。静态注射化学发光检测获得了发光反应完整的动力学曲线，但研究发现，静态注射化学发光所获得的动力学曲线寿命短，不同反应体系的 τ 值集中在 1.0 至 3.6 s 范围内；而 CCL 实现了信号的周期性检测，延长了信号观测时间，峰信号随时间衰减的 τ 值差异得到了有效放大。

▲	图 7. （a）6 种手性主体对浓度不同的 12 种手性客体的响应热图。0.005, 0.05 和 0.1 代表手性客体的浓度, 单位为 mmol/L; （b）线性判别分析所得的聚类散点图。A: (R)-(+)-1-苯基乙醇; B: (S)-(-)-1苯基乙醇; C: (R)-(-)-2-戊醇; D: (S)-(+)-2-戊醇; E: (R)-(-)-2-苯甘氨醇; F: (S)-(+)-2-苯甘氨醇; G: (R)-3-氨基-3-苯基丙醇; H: (S)- 3-氨基-3-苯基丙醇; D-(-)-扁桃酸 J: L-(+)-扁桃酸 K: D-(-)-苦味酸; L: L-(+)-苦味酸.

作者们研究了两种构型对映体共存时混合体系 τ 值的变化规律。研究表明：混合体系的 τ 值（以 τ_m 表示）与混合物中对映体的百分含量呈线性关系，且线性回归方程的斜率为两种对映体 τ 值之差，截距为相应某一对映体的 τ 值，亦即 τ_m 为两种对映体 τ 值的加权平均值。根据 ee 的定义，ee 与两种构型对映体的 τ 值关系可表达为：

其中，τ_R 和 τ_S 分别为 R 和 S 构型对映体的 τ 值。因此，若已知 R 和 S 构型对映体的 τ 值，只需采用 CCL 测定获得混合体系的 τ 值，则无需标准曲线，根据上方方程可快速计算混合物中各对映体的百分含量及 ee 值。为快速测定 ee 值提供了新技术。

▲	图 8. （a）采用 R1 为手性主体时混合体系 τ 值与苯基乙醇对映体百分含量的关系；（b）采用 S1 为手性主体时混合体系 τ 值与苯基乙醇对映体百分含量的关系。

为进一步验证 CCL 在快速手性分析中的应用，他们选用(S)-(-)-1-苯基乙醇在酸性大孔树脂催化下的 Walden 转化反应为模型，探索了 CCL 在反应监测中的应用。同时采用 CCL 方法、高效液相色谱（HPLC）方法监测反应曲线，2 种方法所得反应曲线的半衰期高度相近，且不同反应时间的 ee 值吻合良好。

▲	图 9. 在 55 ℃（a）和 65 ℃（b）条件下，采用 CCL 和 HPLC 同时监测(S)-(-)-1 苯基乙醇的转换反应曲线。ω(S)(CCL)、ω(S)(HPLC) 为 CCL 和 HPLC 测定的(S)-(-)-1 苯基乙醇百分含量。

随后，本文作者采用 CCL 检测了 5 个布洛芬药品的 ee 值，CCL 的结果与 HPLC 测定值吻合，绝对误差为 -4.2%—4.0%。实验过程中 HPLC 法需采用昂贵的、特定的手性色谱柱，经手性分离后建立标准曲线方测定 ee 值，而 CCL 无需分离及建立标准曲线，简化了分析流程，有效缩短了分析时间。

最后，作者研究了 CCL 手性识别机理，运用密度泛函理论研究 R1（或 S1）与苯基乙醇对映体可能的相互作用形式。结果表明：R1（或 S1）与苯基乙醇对映体通过氢键作用生成空间结构具有差异性的加合物。4 种加合物的表面增强拉曼光谱亦展现出了差异，理论计算结果揭示了这可能是苯基乙醇对映体 C-O 键的伸缩振动使羟基靠近 R1（或 S1）的 N 原子，与之形成氢键，使拉曼峰位产生差异。作者也采用 HPLC 研究了 R1 和 S1 两种手性主体，及其分别与苯基乙醇对映体混合后（4 种加合物），对鲁米诺 –H₂O₂ 反应的催化活性。研究表明：鲁米诺- H₂O₂ 反应在不同手性体系催化作用下的动力学曲线衰减顺序与 CCL 动力学曲线衰减顺序一致。因此，推断 τ 值与催化活性有关，手性主-客体通过手性-手性相互作用生成空间结构不同的新加成物，这些加成物对鲁米诺- H₂O₂ 反应的催化活性不同，CCL 测定过程延长了信号观察时间，获得 τ 值不同的动力学曲线，未来仍需开展大量实验研究以进一步揭示 CCL 手性识别的规律。

▲	图 10. 采用 CCL 和 HPLC 监测(S)-(-)-1 苯基乙醇在 55 ℃（a）和 65 ℃（b）条件下的转换反应曲线。ω(S)(CCL) 和 ω(S)(HPLC) 分别代表 CCL 和 HPLC 测定的 (S)-(-)-1 苯基乙醇的百分含量

小结

本文作者最后总结到，本研究不仅提供了一种全新的快速光学手性分析新策略，而且为研究分子间互相作用提供了潜在有效的技术。作为一种新的化学发光分析策略，CCL 的应用范围仍有待进一步挖掘。

本文报道的研究工作得到了国家自然科学基金项目(Nos. 21605163, 21675178，21976213)、广东省重点领域研发计划项目（No.2019B020211001）和国家重点研发计划课题（No.2019YFC1606101）的资助。张润坤博士为第一作者，李攻科教授为本文的通讯作者。

论文信息

• Rapid Chiral Analysis Based on Liquid-Phase Cyclic Chemiluminescence
  Runkun Zhang, Yanhui Zhong, Zhen-Yu Lu, Yanlong Chen and Gongke Li*（李攻科，中山大学）
  Chem. Sci., 2020

原文链接
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2021/sc/d0sc03496g#!divAbstract

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