南卡莱罗纳大学张利博博士、王倩教授综述： P450 酶在生物技术和合成生物学中的应用

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细胞色素P450s是包含血红素（heme）作为辅助因子的一个庞大的酶超家族。由于其独特的结构和催化机制，P450s在合成生物学和生物技术应用领域受到广泛关注并展现巨大的应用潜力。近日，南卡莱罗纳大学王倩教授应邀在ChemBioChem 期刊上发表综述文章（Harnessing P450 Enzyme for Biotechnology and Synthetic Biology），总结了如何有效利用P450酶从而促进其在生物技术和合成生物学领域应用的最新研究进展。已报道的P450s的功能包括羟基化、环氧化、脱羧、N-/O-脱烷基、脱卤、硝化、C-C键断裂或偶联异构化等。为了提高P450的酶活性，多种技术策略不断涌现，包括底物修饰，辅助小分子开发，非自然酶级联反应，多酶体系构建以及酶与材料的相结合等。这些技术可以直接应用于相关的酶，也可以和酶工程技术相结合，在合成生物学应用领域中具有独特的优势。在该综述文章中，作者对在P450酶领域最新出现的相关技术进行了回顾和讨论，对其在合成生物学应用中的前景进行了展望。结合本实验室的相关研究工作包括酶与高分子的自组装，新型小分子探针设计，作者对该领域研究方向提出了一些建议。综述通讯作者为南卡莱罗纳大学王倩教授，第一作者为南卡莱罗纳大学博士张利博（现为加州大学戴维斯分校博士后）。该综述被邀请作为ChemBioChem的内封面文章。

P450s 在合成生物学和生物技术领域引起了越来越多的关注。为了提高其催化效率，已经开发了不同的策略，包括底物工程、变构效应分子、基于Decoy的小分子、非自然酶级联反应、一锅多酶反应体系 (OPME) 和酶与材料相结合。这些研究工作对其他酶的研究和多个应用领域都具有重要意义。

本篇综述从六个方面对近年来在P450催化领域发展的技术策略进行了讨论。第一部分，作者首先介绍了在P450家族中发现的底物辅助催化现象，这种现象在多种酶催化反应中被发现包括P450eryF，P450BSβ， P450SPα，P450 CYP121，OleT 等。然后作者介绍了基于变构效应而设计的功能小分子在P450酶催化中的最新进展，包括用孕酮小分子(PGS)对CYP3A变构位点进行化学修饰等。第二部分，作者介绍了底物工程技术及其对P450酶催化调节的应用，作者回顾了对底物进行‘对接/保护基团’修饰的策略，以及基于酶天然底物的结构而设计的对多种非天然底物进行修饰的策略来提高酶的活性及选择特异性。在第三和第四部分，作者介绍了诱饵分子（Decoy）在P450酶催化中的研究进展，并重点介绍了基于这一策略的新型双功能小分子的设计及其对P450BM3催化活性的调节。在本部分，作者对本实验室开展的基于OleT酶独特催化特点而设计的新型探针及小分子激活剂的开发等相关工作进行了总结。第五部分，作者回顾了人工设计的酶级联反应在P450的应用，包括本课题组最近提出的应用葡萄糖氧化酶（GOx）和OleT耦联反应来避免过氧化氢的副作用进而提高P450酶催化活性。基于特定P450酶包括P450BM3和P450Rh的氧化还原功能结构域的分析，蛋白融合技术也被用于有效提高OleT的催化效率。然后作者围绕如何提高OleT的脱羧酶活性回顾了一锅多酶反应体系 (OPME) 在提高P450酶催化反应效率中的研究。第六部分，作者讨论了P450和材料相结合在酶催化中的应用，包括优化空间效应，促进中间产物传递等。作者重点介绍了基于电化学驱动的P450酶催化的固化策略以及应用高分子聚合物对P450酶进行包裹以提高其稳定性和有机溶剂的耐受性等。最后该综述对多学科交叉对促进P450酶在合成领域的应用进行了展望。

图1（A）P450催化的羟基化反应示意图（B）P450 RevI (PDB 3WVS, 橙色) 和P450 OleT （PDB 4L40， 绿色）结构叠加比较（C）P450 RevI和P450 OleT酶活性中心和底物结合区域比较。

图 2 底物辅助的P450酶催化及变构效应模式图以及由此衍生的各种促进酶催化活性的功能小分子策略示意图。

图3 用孕酮小分子(PGS)对CYP3A变构位点进行化学修饰进而促进其催化效率的模式图。

图4 （A）基于‘对接/保护基团’修饰策略的底物工程技术流程图 （B）基于可可碱分子结构的底物工程技术在CYP3A4催化赖索茶碱中的应用。（C） 基于PiKc 酶的天然底物YC-17 和纳博霉素分子结构的底物工程技术及相应的酶活性，选择特异性比较。

图5 诱饵分子（Decoy）策略及相关的新型小分子在P450酶催化中的应用汇总

图6 （A）葡萄糖氧化酶（GOx）/p450 OleT酶级联反应模式图及利用P4VP高分子组装进一步提高其催化效率的模式图。（B）OleT-BM3氧化还原结构域融合酶结构模式图及其与NADPH循环利用多酶体系相结合用于烯烃的生产。（C）基于OleT和P450-BM3的多酶体系建立及其应用。（D）基于纤维素-纤维素结合蛋白结构域-脂肪酶-OleT的多酶体系模式图。

该项研究获得了NSF #OIA-1655740 下的 SC EPSCoR/IDeA 计划的支持。

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https://chemistry-europe.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/cbic.202100439

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