王峰/谢君/楼宏铭/潘学军/朱俊勇RSER综述：驯服木质纤维素酶解糖化过程中的“lignin dog”以得到经济和可持续的糖平台

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木质纤维素是生物质的主要存在形式，地球上每年通过光合作用生产1000多亿吨的木质纤维素。将木质纤维素中的纤维素通过纤维素酶水解转化成单糖，再由糖平台进一步通过化学和生物的方法转化成不同的目标产物是生物炼制的重要环节（图1）。相比于酸水解制糖，木质纤维素的酶解糖化具有反应条件温和、专一性强和环境友好的优点。

图1. 木质纤维素的糖平台转化及纤维素酶水解机理图
木质素在酶解过程中不仅会物理阻碍纤维素酶对纤维素的可及性，并且会无效吸附纤维素酶，因此通常认为木质素会抑制纤维素的酶解。通过预处理可以减少木质纤维素原料中木质素的含量，使底物的可酶解性得到改善，但是完全去除底物中的木质素在经济上是不可行的，因为漂白浆（去除木质素后的纤维素/半纤维素）的价格加上酶解的成本远高于葡萄糖的成本。因此，在木质纤维素酶解过程中木质素是必须要面对的问题。
一些新的研究表明，在适当的条件下，木质素不会抑制木质纤维素的酶解，甚至可以提高最终的糖产量。例如，最近开发了一些新的木质素导向的预处理方法，它们可以减少或克服木质素的抑制作用。研究人员还发现，木质素被功能化后可用作木质纤维素酶解的活化剂/促进剂，其效果与常见的高效表面活性剂相当。此外，木质素还可以被改性为纤维素酶的载体，在酶解过程中回收纤维素酶，降低纤维素酶的负载和成本。这些工作表明，木质素在木质纤维素酶解过程中可扮演多重角色，并且能发挥积极的作用（图2）。本文综述了研究人员如何驯服“lignin dog”以促进木质纤维素酶解的研究进展。

图2. 驯服纤维素酶解过程中的“lignin dog”以获得经济和可持续的糖平台
木质素通常是由三种基本的苯丙烷单体通过自由基聚合而成，主要含有C-C键和C-O键，并且含有羧基、酚羟基、甲氧基、苯环等特征结构单元（图3）。木质素对纤维素酶的抑制作用在很大程度上取决于其结构。由于木质素结构的复杂性和异质性，很难将木质素对酶水解的抑制作用归因于特定的木质素结构特征或性质，因为改变官能团或化学键往往会导致改变其他性质。威斯康辛大学潘学军教授课题组使用一系列结构明确的木质素模型化合物研究了木质素官能团对Avicel酶解的影响，发现酚羟基抑制纤维素水解，而甲氧基没有表现出明显的抑制作用。他们通过研究硬木和软木中两种具有不同物理化学性质（分子量、脂族羟基、酚类羟基和疏水性）的木质素样品对Avicel酶解的影响，发现疏水性和酚类羟基都与木质素抑制密切相关。

图3. 木质素的主要单体、分子结构和模拟的分子构象
木质纤维素的化学预处理是去除木质素顽抗性的最有效手段。常见的化学预处理包括稀酸、碱、水热和有机溶剂工艺。大多数预处理条件（强酸或强碱、高温和高压）可能导致木质素缩合。缩合的木质素不仅沉积在纤维素表面形成物理障碍，而且由于疏水性增加而吸附纤维素酶，导致纤维素酶失活。此外，化学预处理，特别是稀酸预处理，由于去除了半纤维素，通常会增加预处理基质中的木质素含量。通常，预处理可以采取以下三种策略来减少对木质素的抑制：1）增加木质素的亲水基团，促进木质素的去除（溶解），削弱纤维素酶与底物中残留木质素之间的疏水相互作用；2）通过添加保护剂防止苄基碳阳离子的形成和缩合；3）降低预处理的严重程度以降低木质素缩合反应的速率（图4）。

图4. 不同的与处理策略来削弱木质素对酶解的影响
表面活性剂可用于增强木质纤维素的酶解，其中非离子和两性离子表面活性剂表现最好。表面活性剂的促进机制主要归因于表面活性剂减少了纤维素酶在木质素上的非生产性吸附，并保持了纤维素酶活性。由于大多数有效的表面活性剂都是昂贵且不可回收的，研究人员试图将廉价且易于获得的木质素改性为添加剂，以增强酶水解。未经修饰的分离木质素通常抑制或不显著影响纤维素酶活性。但是在木质素上接枝阴离子基团、阴离子/阳离子基团以及亲水链段可以合成高效的木质素基添加剂，以增强木质纤维素的酶解作用（图5）。

图5. 不同类型的用来促进木质纤维素酶解的木质素基表面活性剂
由于木质素和纤维素酶之间存在多种非共价相互作用，木质素可用于通过吸附固定纤维素酶的不同成分。以木质素为载体回收纤维素酶具有明显的优势。一方面，木质素是木质纤维素酶促糖化的副产物，价格低廉，易于获得；另一方面，木质素可以通过非共价相互作用吸附纤维素酶，避免了共价键导致的酶活性损失。通过回收酶水解后的不溶性残留物，可以回收纤维素酶，因为残留的木质素吸附了部分纤维素酶。然而，未经修饰的木质素固定纤维素酶的能力有限，通常会抑制纤维素酶的活性。因此，在固定化之前对木质素进行适当的改性是必要的。目前主要有三类木质素基载体用来回收纤维素酶：1）不溶性木质素接枝酚类化合物以增加纤维素酶的吸附固定纤维素酶；2）木质素接枝阴阳离子基团改性为两性离子表面活性剂通过pH响应回收纤维素酶（图6）；3）将木质素固定在磁性颗粒上通过非共价键吸附纤维素酶，再通过磁力回收纤维素酶。

图6. 木质素两性表面活性剂通过pH响应来回收溶液中纤维素酶
在过去的40年里，木质素对木质纤维素酶解的影响得到了广泛的研究，这些努力极大地促进了木质纤维素转化为糖平台的发展。然而，仍有许多与木质素相关的问题和挑战需要解决，以使纤维素糖在市场上更具竞争力。作者推举如下四个研究方向：1）通过基因工程操纵植物中木质素的含量、分布和分子结构；2）了解和控制预处理过程中木质素分子结构和聚集体形态的变化；3）将木质素改性为更有效的酶水解添加剂（促进剂）或纤维素酶回收载体；4）将酶解木质素转化为高价值产品。

作者简介

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第一作者

华南农业大学蔡诚副教授

https://ibe.scau.edu.cn/2023/0509/c13907a345603/page.htm

本文通讯作者

中科院大连化学物理研究所王峰研究员

http://www.fwang.dicp.ac.cn/index.htm

华南农业大学谢君教授

https://ibe.scau.edu.cn/2021/0908/c13906a289257/page.htm

华南理工大学楼宏铭教授

https://www2.scut.edu.cn/sklppe/2017/1226/c13898a241974/page.htm

威斯康辛大学潘学军教授

https://bse.wisc.edu/staff/pan-xuejun

美国农业部林产品实验室朱俊勇教授

https://bse.wisc.edu/staff/zhu-junyong-jy

原文链接

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1364032123003027

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