微课回顾 | How does stLFR get LFR(含FAQ)

在基因组学研究中，长短片段相结合、多种测序技术齐上阵已成为趋势。而华大智造自主研发的stLFR技术集短片段与长片段优势于一身，拥有强大的性能和广泛的应用场景。

为什么需要LFR

短读长测序有诸多优势，是目前应用最广泛的测序方法。但在组学研究中，也需要长片段构建的基因组图谱、大型结构变异检测、高度同源基因研究、单倍体型分析等信息。

stLFR技术原理

华大智造自主研发的stLFR技术是一项基于高精度短读测序方法获取长片段DNA信息的创新技术。该技术仅需单管操作，从已提取好的长片段DNA起始，将转座子序列随机插入至长片段DNA中，然后利用一段夹板引物将转座子与带有多拷贝分子标签的磁珠载体结合，再引入第二个接头后进行PCR扩增和环化，最终完成文库构建，进行高通量测序。

stLFR独特优势

由于同时兼顾长读长及短读长的测序优势，stLFR不仅能够获取全面的长片段DNA信息（10kb-300kb），还可以通过一次检测获得各种类型的变异信息（包括SNP、InDel、CNV和SV），同时对于高度同源的基因组，也能够获得更好的比对效果。

stLFR用户数据

stLFR技术自面世以来受到用户的广泛欢迎，在临床探索及科学研究中解决了很多实际问题。尤其在肿瘤研究、人人基因组及动植物De novo等领域，能够高效、高质量、低成本升级现有技术平台。

 》》基于stLFR技术的肿瘤样本检测 

在对肿瘤样本进行RNA测序时发现IRF4 intron5 和BLOC1S5的Exon5存在结构变异，推测chr6上有可能发生倒位，因而想在DNA层面进行验证。由于样本很珍贵，只有ng级别，且样本严重降解，单分子测序技术或纳米孔测序技术对样本起始量要求较高（需要ug级别），对于此类样本往往束手无策。而华大智造的stLFR技术只需1.5ng即可满足建库需求。因此，采用了stLFR技术对其进行验证，而结果也证实：该结构变异确实是由于chr6的398104-8014571位置发生了倒位而引起的。

》》人人基因组

采用高深度stLFR+低深度ONT技术进行人基因组组装，能够获得高质量高精度的个人基因组数据。目前业内对于人类基因组测序的“金标准”是“676”，指的是序列拼接的contig长度达到10的6次方，序列拼接的scaffold长度达到10的7次方，人类双倍体基因组共6G基因序列能够做到单倍体定相。即：

· Contig N50＞10⁶ bp

· Scaffold N50＞10⁷ bp

· 组装全基因组数据＞6G

》》动植物De novo

近期在bioRxiv上发表的一项研究显示，对比常规的长读长为主、短读长为辅的组装方法，使用stLFR技术为主、长读长为辅的方法也能够获得类似的组装效果，而成本仅为常规方法的五分之一。研究同时对比了不同组装结果的准确性，结果显示使用stLFR技术，indel以及mismatches的错误率均是最低的。因此，在动植物领域，相较于传统方法，使用stLFR技术能够用极低成本获得相同质量数据，且结果更准确。

小贴士

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FAQ精选

1、在建库过程中，如何能够保证一条长片段上只结合一个磁珠？

通过控制投入磁珠与DNA比例来实现一条长片段上只结合一个磁珠，单次建库会投入三千万颗磁珠以及1.5ng的DNA，由于每个磁珠上的barcode都是唯一的，因此在这种比例下，可以确保大部分的微珠仅结合一个分子的长片段DNA，如果有少量磁珠捕获多条DNA分子，也可通过后续生信分析进行区分。

2、是否可以理解为：stLFR是再加一个barcode来对长片段进行区分么？

是的，stLFR的barcode种类有36亿种，在单管内通过虚拟隔离技术进行区隔，在文库构建时，对来源同一长片段DNA的reads添加相同barcode，不同长片段DNA添加不同barcode来进行区分。因此能够确保每个长片段DNA片段都有独一无二的barcode。

3、stLFR能否实现长片段从头组装？

可以做从头组装，先通过reads的overlap关系构建contig，再利用stLFR提供的长片段信息构建scaffold。

参考文献：

Comparison of long read methods for sequencing and assembly of a plant genome. 

doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992933

拓展阅读

会议推荐

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文章作者澳大利亚昆士兰大学Lachlan教授

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