小麦未知基因的快速克隆方法6—利用BSA+RNA-Seq进行快速定位

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        鉴定与重要农艺性状紧密连锁的分子标记在作物育种中意义重大。今天我们跟大家分享一篇2015年发表在PBJ上的文章（doi:10.1111/pbi.12281）。本文利用BSA和RNA-Seq技术，结合F2分离群体，完成了小麦条锈病抗病基因Yr15的精细定位。当然，由于现在小麦的的参考基因组和注释都已经相对完善，我们在利用BSA+RNA-Seq进行目标基因的初步或精细定位时，并不一定完全按照本文的策略进行。

        作者首先利用含有Yr15基因的近等基因系与感病材料Avocet杂交并创制F2群体，简单的遗传分析发现Yr15为单显性抗病基因，后代符合3:1的抗感分离比例。作者对包括187个抗病单株和45个感病单株的混合池进行取样并进行RNA-Seq测序，同时对两个抗感亲本进行测序。测序数据分别比对到NCBI上小麦的UniGene数据库以及UCW基因数据库（包含15万以上的基因），并进行SNP的calling。结果发现，利用UniGene数据库可以鉴定到更多的SNP，这很可能是由于UniGene数据库里并没有区分小麦的三套亚基因组而造成的；而UCW数据库中是区分三套亚基因组的，因此可靠性更高。在保留了真实有效的SNP后（抗感亲本一致的SNP被过滤掉），作者将SNP数据比对到中国春分染色体的参考（CSS）后发现，用来构建群体的感病亲本Avocet所特有的SNP遍布整个基因组，由此说明用来构建群体的Avocet和用来构建Yr15近等基因系的轮回亲本材料并不相同。

        由于根据感病或抗病表型对样品进行了分类，对于同一个SNP位点来说，在两个池中某一亲本基因型所占频率的比值记为BFR值（bulk frequency ratios）。如果以抗病亲本的基因型（Yr15 type）计算BFR值，在抗性池里BFR值应该更高，对应的感病池里值越低。经过统计之后发现，当BFR值大于6时一共鉴出了来自于1173个基因的1582个SNP的，其中有大约60%的SNP被定位到小麦的第一同源群，而剩余的SNP并不在染色体某一位置富集。在这些被定位到第一同源群的SNP中，大约有一半来自于1B染色体，并且在长臂和短臂上平均分布，这说明Yr15很可能定位在1B染色体的着丝粒区域。

        作者又利用这些SNP信息开发了28个KASP标记，并在66个F2单株中进行了验证。其中有23个SNP标记与Yr15连锁。利用232个F2单株，作者最终将Yr15定位到了标记R8/Xgwm413和R5/R11之间大约0.77cM的区间。当然，由于这个区间位于着丝粒区域，其对应的物理图谱还有很大。这也是利用连锁交换关系进行基因定位的巨大弊端，也是说当目标区间的交换率比较低的时候，很难通过扩大群体的方法来缩小候选区间，想利用正向遗传学进行基因克隆的难度巨大。

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