CRISPR技术在基因激活和抑制中应用（超详细，值得珍藏）

来源：实验狗

转录的定向调节对理解复杂的基因网络有着重要的意义，并且在医学和工业应用上也有着巨大的潜力。在目标基因组激活和抑制的领域里，CRISPR是一种新兴的实验技术，同时它也能参与基因的编辑。

以下为大家介绍在哺乳动物细胞中，如何设计、构建和验证向导RNA（sgRNA，single guide RNAs）对特定的转录序列进行抑制或者激活。在这个技术中，去活性的核酸酶Cas9蛋白（dCas9）被释放出来，为RNA导向基因组任何位置的目标DNA提供了一个平台。而不同种sgRNA能激活或抑制不同的基因。并且使用scRNAs（scaffold RNAs）能够让不同的效应蛋白招募到不同的基因序列中，从而激活一部分基因，抑制另一些基因。CRISPRi和CRISPRa的方法为基因表达的特异性调节提供了有效的工具，使人们能够更好地了解基因的功能。

1名词解释

CRISPR：规律成簇间隔短回文重复（Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats），这是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。

CRISPRi：（sequence-specific repression）基因特异性干扰

CRISPRa：（sequence-specificactivation）基因特异性激活 

dCas9：（deactivated Cas9）去活性的Cas9蛋白。

sgRNA：（single guide RNA）向导RNA。

2实验材料

试剂：

Cas9表达载体:

a. CRISPR activation (CRISPRa) dCas9–SunTag表达载体：

b. CRISPR interference (CRISPRi) dCas9–KRAB表达载体：

sgRNA表达载体：

慢病毒包装载体pCMV-dR8.2和pMD2.G ：

注：详细载体信息可登陆http://www.addgene.org/查询。

大肠杆菌感受态细胞

dNTPs(10mM)

ddH2O

高糖的DMEM基础培养基

胎牛血清（FBS）

HEK293T细胞

琼脂糖

DNA maker

溴化乙锭或goldview

TAE buffer

DNA连接试剂盒

荧光定量试剂盒

反转录试剂盒

慢病毒包装质粒pCMV-dR8.91和pMD2.G

含有羧苄青霉素的LB培养基（液体和固体平板）

转染试剂盒

双抗（Penicillin-Streptomycin (100×)

高保真酶

质粒提取试剂盒（去内毒素）

胶回收试剂盒

PCR产物纯化试剂盒

限制性内切酶BstXI，XhoI和DpnI

Trypsin-EDTA（0.05%）

引物：

sgRNA-F: 5′-CCCTTGGAGAACCACCTTGTTGGN(19)GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCA-3′

sgRNA-R: 5′-GATCCTAGTACTCGAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3′

 （注：sgRNA-F引物序列包含了sgRNA对应的靶点序列）

测序引物: 5′-GAGGCTTAATGTGCGATAAAAGA-3′

设备：

流式细胞仪

荧光定量PCR仪

CO2培养箱

凝胶成像系统

细菌培养箱

核酸定量仪

PCR仪

3实验步骤

1基因组中sgRNA靶点序列的选择

1、确实目标基因的DNA序列（可以使用基因组数据库，如UCSC genome browser（http://genome.ucsc.edu/））。[2]

2、获取目标基因的注释信息，包括转录起始位点（TSS）的位置。

3、在转录起始位点（TSS）附近找GN(19)NGG样式的序列，GN(19)样式的序列是sgRNA的结合位点，NGG是Cas9蛋白结合DNA的一个基序，称为PAM（protospacer adjacent motif）。

备注：1.本步骤中的sgRNA的表达构建用的是老鼠的U6启动子，需要在5’末端加一个G，这样能够有效的转录。同时，找到目的基因的GN（19）基序作为sgRNA的结合位点。如果用的是其他的启动子，很有可能5’末端的第一个核苷酸会不一样。

2.推荐的CRISPR干扰（CRISPRi）区域范围是在目的基因的转录起始位点的−50 - 300 bp左右。CRISPR激活（CRISPRa）则是在（−400）-（−50）bp，通常sgRNA的最适结合位点需要通过实验摸索。

3.很多的哺乳动物的基因拥有多个不同转录起始位点的转录本亚型，因此，需要设计不同的sgRNAs来对应不同的转录本。目前，还没有直接的证据证明CRISPRi和CRISPRa的活性与DNA链或者GC含量有关。

2sgRNA序列的设计

4、设计sgRNA序列时，保证sgRNA的碱基对序列与目的DNA上的GN(19)序列（步骤3中确定）是反向互补的。

5、分析目的基因序列在基因组中的特异性，可用BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）实现。[3]

6、将GN(19)序列的3’端加到最佳的sgRNA序列上，从而产生完整长度的sgRNA。如下：5′-GN(19)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCATAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3′。[4]

7、确定GN(19)序列中不含有U6启动子的任何的转录终止序列。[5]

3sgRNA表达载体构建

8、用限制性内切酶BstXl和XhoI来酶切空的sgRNA表达载体， 37°C，4-16h（根据不同的酶的相关说明书）。

9、将酶切后的产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，缓冲液是1×TAE buffer，用数字凝胶成像系统观察条带，确定载体的条带是在8kb左右。

10、使用胶回收试剂盒来回收酶切后的质粒，将回收的质粒DNA保存在−20°C以便后面的步骤中使用。

11、进行PCR扩增实验，用含有20-nt目标基因序列的引物（步骤3中确定的）。以下为PCR反应体系：

反应物	体积
没有酶切的空sgRNA表达载体（100 ng/µL）	0.5  µL
上游引物（sgRNA-F）（10 µM）	2.5  µL
下游引物（sgRNA-R）（10 µM）	2.5  µL
dNTPs  (10 mM)	2  µL
高保真酶（2 U/µL）	0.5  µL
酶缓存液（5×）	10  µL
ddH2O	32  µL
总体积	50  µL

反应条件：

1  cycle	98°C	30  sec
25  cycles	98°C	10  sec
62°C	30  sec
72°C	10  sec
1  cycle	72°C	5  min
1  cycle	4°C	Forever

12、取5 µL PCR产物，用1%的琼脂糖跑胶，确保成功扩增出大约150bp的目的片段。

13、加1 µL DpnI (20 U/µL)到PCR产物中，37°C温育1h。（Dpnl能够消化PCR模板）

14、用PCR产品纯化试剂盒纯化PCR产物，得到的DNA保存在−20°C。

15、用核酸定量仪（NanoDropUV-Vis 8000）检测酶切纯化后的sgRNA载体和步骤14得到的PCR产物。

16.连接sgRNA载体和PCR产物，连接体积如下：

连接酶（如：In-Fusion HD Enzyme Premix (5×)）	1 µL
线性的sgRNA载体	50 ng
纯化的PCR产物	25 ng
ddH2O	x µL
总体积	5 µL

50°C温育15min。冰上放置5min后，−20°C保存。

17、将连接好的质粒转化大肠杆菌，将转化好的大肠杆菌涂到含有100 µg/mL羧苄青霉素的LB培养基平板中，放到培养箱中，37°C培养过夜。

18、待平板中长出菌落，用无菌的移液枪枪头挑单菌落到5ml的LB培养液中（含有100 µg/mL羧苄青霉素），将其放到摇床中，37°C，200 rpm/min培养过夜。

19、取0.5 mL上述过夜的菌液到含有50mlLB培养基（含有100 µg/mL羧苄青霉素）的锥形瓶中，将其放到摇床中，37°C，200 rpm/min培养过夜。

20、取4.5 mL的菌液，用质粒DNA提取试剂盒提取质粒。

21、将提取的重组质粒和测序引物送到测序公司测序。

22、测序成功后，用质粒中提试剂盒提取50ml菌液的质粒，保存在−20°C中，等待步骤27用。

4dCas9表达载体的制备

23、根据实验目的，将对应的dCas9表达质粒转化到大肠杆菌中，将转化好的大肠杆菌涂到含有100 µg/mL羧苄青霉素的LB培养基平板中，放到培养箱中，37°C培养过夜。

24、待平板中长出菌落，用无菌的移液枪枪头挑单菌落到50ml的LB培养液中（含有100 µg/mL羧苄青霉素），将其放到摇床中，37°C，200 rpm/min培养过夜。

25、用质粒中提试剂盒提取50ml菌液的质粒，保存在−20°C中，等待步骤27。

5将dCas9和sgRNA表达序列包装到慢病毒颗粒中

26、转染前，按每孔2–3 × 105 HEK293T细胞接种到6孔培养板中（每孔2 ml的高糖DMEM（含10%FBS）），在培养箱中，37°C，5% CO2培养过夜。

备注：HEK293T细胞能在培养基（含高糖的DMEM基础培养基，10%FBS，100 U/mL链霉素和100 U/mL的青霉素）中生长，0.05% (w/v) trypsin–EDTA消化传代。但转染时在无抗生素的培养基中进行更有效。

27、培养24h后，细胞贴壁，准备转染体系：

a.将以下的质粒预混：

pCMV-dR8.91 (lentiviral packaging plasmid)  1.32 µg

pMD2.G (lentiviral packaging plasmid)             165 ng

dCas9 or sgRNA expression construct             1.51 µg

注：可用不含目的基因序列的sgRNA载体或没有融合表达的dCas9质粒作为阴性对照。

b.取上述3 µg量的DNA预混物到250 µL的Opti-MEM Reduced-Serum培养基中，用移液器上下吹打。

c.加7.5 µL的MirusTransIT-LT1转染试剂到上述混合物中，上下吹打混匀。

d.将上述混合物在常温下放置30min，使其形成转染复合体。

28、将培养了细胞的6孔板中的培养基吸去250 µL。

29、将步骤27中的混合物加到6孔板的其中一个孔中，来回轻轻摇摆混匀，37°C，5% CO2培养24h。

注：转染24h后，细胞开始产生病毒。

30、转染24h后，吸去6孔板中的培养基，重新加入2.5mL新鲜的DMEM（含10% FBS）。

注：如果转染的细胞培养时需要其他成分的培养基，可在换培养基时加入相应的成分。

31、换液后培养24-48h，用无菌的注射器收集病毒上清，0.45 µm的针式滤器过滤上清，用圆锥管收集。

注：过滤后的总体积大约为2 mL，慢病毒颗粒在4°C条件下可保存1周，用液氮速冻保存在−80°C，可保存几个月。但是推荐收集后马上使用。

6dCas9和sgRNA慢病毒颗粒导入目的细胞

注：在以下实验中，用HEK293T细胞作为例子，对于其他类型的细胞，请适当修改步骤，如：细胞的数量和培养基等。

32、在转导前16h，按每孔1.5–2 ×105 HEK293T细胞接种到6孔培养板中（每孔2 ml的高糖DMEM（含10%FBS）），在培养箱中，37°C，5% CO2培养过夜。

33、吸去细胞上清培养基，加入1 mL的DMEM（含10%FBS）和1 mL的步骤31收集的病毒上清液到培养板中，37°C，5% CO2培养过夜。

注：对于不同的细胞，根据病毒的滴度，适当加培养基来稀释病毒上清液。适当浓度的聚凝胺能够增加病毒感染细胞的效率；但是它对一些细胞有毒性，包括HEK293T细胞。

34、吸去病毒上清液，重新加入2 mL新鲜的DMEM（含10% FBS），37°C，5% CO2培养48h。

注：细胞通常在加入慢病毒颗粒后48h会表达dCas9蛋白，但是对于抑制实验，建议是感染72h后收集细胞，以至于能最小限度地降低之前已存在于细胞中的目的基因mRNA的干扰。

35、使用流式细胞分选仪（BD FACSAriaII Cell Sorter）来收集细胞。

 a.对CRISPRi系统，需要收集蓝色荧光蛋白（BFP）和红色荧光蛋白（mCherry）阳性的细胞。

注：蓝色荧光蛋白阳性细胞表达dCas9蛋白，红色荧光蛋白阳性细胞表达sgRNA。

b.对CRISPRa(dCas9–Suntag)系统，需要收集BFP，mCherry和绿色荧光蛋白（GFP）阳性的细胞。

注：绿色荧光蛋白阳性细胞表达scFv-sfGFP-VP64融合蛋白。

36、收集细胞后，37°C，5% CO2培养。

注：细胞生长之后，用qPCR的方法分析目的基因的表达水平。

6检测CRISPRi或CRISPRa后，目的基因的表达量

37、收集细胞，使用RNA提取试剂盒提取细胞的总RNA。

注：通常提总RNA至少需要0.5–1 × 106个细胞。

38、用核酸定量仪（NanoDropspectrophotometer）来检测总RNA的浓度。

39、用反转录试剂盒合成cDNA，步骤可根据相应的试剂盒说明书。

40、用qPCR检测分析目的基因的表达量。

4参考文献

[1]Dan Du, Lei S. Qi. 2016. CRISPRTechnology for Genome Activation and Repression in Mammalian Cells. Cold SpringHarb Protocol: doi:10.1101.

[2] Kent WJ, Sugnet CW, Furey TS, RoskinKM, Pringle TH, Zahler AM, Haussler D. 2002. The human genome browser at UCSC.Genome Res 12: 996–1006.

[3] Bhagwat M, Young L, Robison R.R. 2012.Using BLAT to find sequence similarity in closely related genomes. Curr ProtocBioinformatics Chapter 10: Unit 10.18.

[4] Chen B, Gilbert LA, Cimini BA,Schnitzbauer J, Zhang W, Li GW, Park J, Blackburn EH, Weissman JS, Qi LS, etal. 2013. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimizedCRISPR/Cas system. Cell 155: 1479–1491.

[5] Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z,Brar GA, Torres SE, Stern-Ginossar N, Brandman O, Whitehead EH, Doudna JA, etal. 2013. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription ineukaryotes. Cell 154: 442–451.