基因治疗发展历程概述与展望
来源：Viva BioInnovator
1.前言
2018年11月，由中国科学家贺建奎主持的基因编辑婴儿事件，引发了中国社会乃至全球对基因编辑技术的讨论。一时间，有关基因编辑、基因治疗等的相关话题与资讯开始大量见诸报端和社交网络，使得社会公众都加入到了对基因治疗的认知热潮之中。
实际上，基因治疗的最早尝试可追溯到1970年的一场未经批准的临床治疗开始，当时美国医生Stanfield Rogers试图通过注射含有精氨酸酶的乳头瘤病毒来治疗一对姐妹的精氨酸血症，该尝试以失败告终。此后十余年内，生物医学界逐步奠定了基因疗法的理论基础和技术基础，相应的公共监管体制也在上世纪80年代迅速建立起来，并在90年代起正式批准基因疗法用于人体临床试验。经过近半个世纪的发展，基因疗法已在基因缺陷病治疗、肿瘤治疗等相关临床试验中展现了强大的功效，且陆续有产品分别在中国、俄罗斯、美国和欧盟等地区上市。此外，近几年世界主流药监机构对基因疗法的扶持力度加大[1][2]，进一步刺激了其市场成长空间，基因治疗行业已经发展成为投资界热捧的领域。
2. 基因疗法的技术基础
基因疗法的诞生与科学界对遗传物质认识的深入及基因工程技术的发展息息相关。从上世纪50年代初到60年代中期，以Francis Crick和Alfred Hershey为代表的科学家们揭开了生物遗传的神秘面纱，他们陆续发现了DNA、RNA、质粒等遗传物质的功能，并发现了基因操作工具酶如聚合酶、连接酶、限制酶等；同一时期，James Watson 与Francis Crick 确定了DNA双螺旋结构模型，并提出了分子生物学中心法则和tRNA假说等理论，这些研究奠定了现代遗传学的物质与理论基础。从70年代起，基因工程技术的发明带动了基因传输、获取和编辑等与基因疗法密切相关的关键技术的开发，一些重要的基因工程技术如基因载体技术、基因克隆技术、聚合酶链式反应（PCR）技术、基因编辑技术等给现代基因疗法技术带来了深刻的影响。
2.1 基因传输技术
2.1.1 非病毒物理法和生物化学法
非病毒物理法是一种运用物理手段将裸露的DNA递呈至靶基因组的做法，一般有注射法、穿孔法和物理包装法。注射法是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因；穿孔法是使用电穿孔仪、声孔穿透仪、高压气体枪等工具把基因投射到细胞内；物理包装法是应用人工脂质体、胶束、无机纳米颗粒等包装外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织，使之表达。这三种基因传输方法经常以交叉使用的方式出现，如裸露DNA质体、裸露PCR扩增片段、载有基因的纳米颗粒经常使用注射、穿孔的方式递呈到靶基因组。非病毒物理传输方法的优点是工艺程序简单以及免疫原性风险低，缺点则是其低表达率和低递呈效率经常成为临床应用的阻碍。
非病毒生物化学法通常有两种思路：一种是指使用工具酶或者化合物结合外源基因和细胞一起培养的方法，此法与使用酶、蛋白改造基因的基因编辑技术有所区别，1973年由Graham和Van der Eb发明的磷酸钙法是应用最广泛的化学转染方法；另一种方法是使用合成的寡核苷酸片段，以抑制或沉默目的基因的表达，常见的几种方法有：1.用siRNA定位并干扰缺陷基因段mRNA的表达，2. 用双链寡核苷酸作为转录因子激活靶基因的转录，从而降低缺陷基因的表达率；3. 用单链寡核苷酸DNA指导一个突变基因的单碱基改变，使其恢复正常基因的功能。这类方法的优缺点与非病毒物理法基本相同。
2.1.2 病毒载体技术
病毒载体技术是基因疗法最常用的传输技术，由于该方法的基因递呈效率、基因表达率相比非病毒法高出太多，同时又具备高靶向性和高安全性等优点，因此深得科学家们的青睐，病毒载体技术得以大量应用于临床治疗领域之中。
病毒载体技术发端于上世纪70年代，当时科学家们受到格里菲思实验（Griffiths experiment）和Stanfield Rogers事件的启发，注意到病毒能够作为一种有潜力的基因载体。1971年，William.J.Munyon[3]证明单纯孢疹病毒可以作为载体有效地输送胸苷激酶，以达到修复基因缺陷的效果；同年Cark.R.Merril[4]团队在实验中确认载有外源DNA的转导噬菌体可以感染人体体细胞，进而修复细胞中的遗传缺陷。到了80年代以后，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、痘病毒、狂犬病病毒和昆虫杆状病毒等纷纷被科学家开发出来用作基因传输的载体，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒更是被称为四大经典病毒载体，其侵染细胞谱广、效率高等优点广为研究人员所知，对这4种病毒载体的比对分析见图1。
图1：四种病毒载体的比对分析
图片来源：汉恒生物，https://www.hanbio.net/cn/articles/item/330656
近几年来，虽然一些非病毒载体技术（如基因编辑技术）在基因治疗案例中表现亮眼，但仍旧没能够撼动病毒载体技术在临床试验中的主流地位。截止到2017年12月，在3000项涉及到基因疗法的临床试验中，仍有近70%的试验选择了病毒载体法作为基因传输手段[5]，这个优势仍将长期维持下去。
2.2 基因工程技术
2.2.1 基因克隆技术和聚合酶链式反应技术
第一代基因克隆技术在70年代初的一些关键实验中诞生。1972年，Paul Berg通过将来自猴病毒SV40的DNA与λ病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来[6]；在1973年，Herbert Boyer和Stanley Cohen通过将抗生素抗性基因插入到大肠杆菌的质粒中，使用跟Berg同样的切割法和连接法，设计了第一个转基因生物[7]。此后被广泛使用的平末端克隆技术和粘性末端克隆技术都是以这两次实验的经验为基础，利用限制性内切酶能识别并酶切特异 DNA 序列的特性，使目的 DNA 片段和载体产生平末端或粘性末端，然后在DNA 连接酶的作用下，将酶切后的目的 DNA 片段和载体连接成重组 DNA 分子。
基因克隆的成熟经验给了科学家们复制疾病相关基因的信心，1976年，冷泉港实验室和哈佛大学的Tom Maniatis、Argiris Efstratiadis等人率领团队测量并定位了β-珠蛋白基因的几个限制性内切核酸酶切割位点，然后结合poly(dA)·(dT)连接技术将基因分子插入到质粒PMB9中，再通过大肠杆菌转化增殖，成功复制了β-珠蛋白基因[8]，这是世界上第一个被复制的疾病相关基因。1979年，加州大学洛杉矶分校的Martin Cline团队成功将复制的β-珠蛋白基因插入到受辐射小鼠的骨髓中[9]。这些实验证实了基因克隆技术用于基因疗法中的可靠性。
上世纪八十年代，聚合酶链式反应技术（以下简称PCR技术）的发明极大地推动了基因克隆技术的发展。PCR技术是一种用于扩增特定DNA片段的基因工程技术，与培养过程手续复杂、耗时过长的第一代基因克隆技术相比，PCR技术非常简单而高效，只需要使用DNA引物片段、解旋酶、引物、DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸等物在一定的条件下反应，就可以在非常短的时间内复制出大量的特定DNA片段。初代PCR技术由KaryMullis于1983年开发，由于在解螺旋温度、DNA聚合酶等实验条件的设计上有缺陷，这一代技术存在反应效率低、复制易出错的缺点；后来，科学家用嗜热细菌水生栖热菌的Pwo或Pfu酶替代原来的DNA聚合酶，大大改善了PCR技术的设计缺陷。在90年代以后，PCR技术被广泛地运用于新生代基因克隆技术的开发过程中，为基因疗法的进步作出了巨大贡献。
2.2.2基因编辑技术
图2：基因编辑技术发展简史（1985-2014）
图片来源：Chandrasegaran S,Carroll D. Origins of programmable nucleases for genome engineering[J]. Journalof molecular biology, 2016, 428(5): 963-989.
近几年来，作为最先进的基因工程技术之一，基因编辑技术在基因治疗领域开始有活跃的表现。自1996年美国约翰霍普金斯大学的Srinivasan Chandrasegaran团队合成锌指核酸酶（ZFNs）以来，基因编辑已经发展出了三代技术，分别是ZFN技术、类转录激活因子效应核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技术和CRISPR/Cas技术。其中，第三代的CRISPR/Cas技术是目前最为流行的基因编辑技术，它的技术原理是使用 sgRNA（single guide RNA）指导Cas核酸酶蛋白识别并剪辑靶向基因序列；与前两代的ZFN和TALEN技术相比，CRISPR/ Cas技术具有简单、价格低廉、易于编程且非常高效的特点，在靶向精度、制备周期和制作成本这些方面都有突出的优势，特别值得一提的是，CRISPR/Cas可通过添加多个向导RNA而实现多重编辑，因此这款基因编辑技术在发明后不久便迅速获得了普及。但是，CRISPR/ Cas技术比起ZFN和TALEN技术有着更高的脱靶效应，近年来，科学家们在CRISPR/Cas技术的基础上多次进行改良，并逐渐发展出了Base Editor、CRISPR相关转座酶（CRISPR-associated transposase, CAST）[10]和INTEGRATE[11]等基因编辑技术，这些新技术的出现，不仅改善了CRISPR/ Cas技术的脱靶效应，还提升了CRISPR系统的编辑效率和靶向精度。
科学家利用基因编辑技术改造基因已有近20年的时间，但将这种技术运用到基因治疗领域是在2013年之后，当时Prashant Mali等人成功用CRISPR/Cas9技术编辑了哺乳动物细胞[12]，这次试验有力地证明了基因编辑技术能够将外源DNA整合到人细胞内的基因组中。2014年，宾夕法尼亚大学的June团队首次将基因编辑技术应用于人体临床试验中，他们使用ZFN技术修饰CD4-T细胞的CCR5基因，并将这些细胞回输到病人体内，有效地缓解了HIV患者的症状[13]，该试验的成功激励了更多科学家把基因编辑技术用于临床研究。2015年4月，中山大学黄军团队利用CRISPR技术修改了人类胚胎中地中海型贫血基因[14]；同于2015年4月，Hoban团队利用ZFNs特异性靶向于β-珠蛋白基因，有效地实现了β-珠蛋白基因座的基因矫正[15]；2016年7月，四川大学华西医院的卢铀团队开展了首次CRISPR技术的临床实验，从转移性非小细胞肺癌患者中分离出T细胞，并使用CRISPR/Cas9技术敲除细胞中的PD-1基因以增强T细胞的肿瘤杀伤能力[16]；2016年10月，中国科学家刘晓娟、张永平和程晨等人宣布他们成功利用CRISPR/Cas9技术在CAR-T细胞中实现多基因编辑[17]，与常规的CAR-T细胞相比具有更广泛的适用性和更强的肿瘤杀伤能力；2017年9月，Chadwick团队通过腺病毒将BE3（Base Editor 3）送入到小鼠肝脏组织，实现PCSK9基因的敲除，从而降低血浆胆固醇的水平，首次证实了运用Base Editor进行体内组织基因编辑的可行性[18]。
然而，虽然基因编辑技术比病毒载体技术更为高效而精准，但这种技术运用于临床治疗的安全性还有待考验，使用基因编辑技术的最大风险便是其脱靶效应。目前常用的四种基因编辑技术ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9和Base Editor都存在着这一问题，即使是使用单碱基转换技术并把靶突变风险降到最低的Base Editor，今年4月也被报道了其胞嘧啶—胸腺嘧啶编辑器（cytosine-thymine editors）存在不可忽视的脱靶风险[19]。至于新近发布的CAST和INTEGRATE技术，虽然在实验中较ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术已展现出更为卓越的基因编辑性能，但这些技术目前仍处于原理验证阶段，它在临床试验中的有效性和安全性还有待科学家的进一步发掘。
3. 基因疗法的上市情况一览
由于载体毒性问题造成了几例影响恶劣的医疗事件，一度有望上市的基因疗法在21世纪的第一个10年遇冷。世界上第一个基因疗法产品今又生（Gendicine）于2003年在中国上市，但由于它的载体安全性和审批严谨性受到全球其他地区的质疑，这个产品没能动摇全球市场对基因疗法的悲观情绪，随后在中国上市的Oncorine和在菲律宾上市的Rexin-G也由于类似问题没能打入全球市场。
进入21世纪的第二个十年，由于安全性渐渐得到认可，基因疗法的全球市场际遇开始由冷转暖，多款基因治疗产品在欧洲、美国、日本、俄罗斯等地被批准上市：2011年，荷兰公司UniQure开发的基因治疗产品Glybera在欧洲获得批准，该疗法使用的基因载体是腺相关病毒，用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症；2012年，俄罗斯批准Human Stem Cell Institute的产品Neovasculgen上市，用于治疗末梢血管病和肢体缺血；2015年，FDA批准安进公司的溶瘤病毒疗法Imlygic上市，该疗法运用基因改造技术修饰单纯疱疹病毒1，使其具有更强的肿瘤杀伤能力，用于治疗病灶在皮肤和淋巴结且没能通过手术完全清除的黑色素瘤，这是美国批准的第一个运用基因改造技术的医疗产品；2016年，欧洲药品管理局批准一款名为Strimvelis的基因治疗产品，这项疗法可以治疗出生时患有腺苷脱氨酶缺乏症且无免疫系统功能的儿童；2017年8月和10月，FDA批准两项使用基因修饰技术的CAR-T细胞治疗产品Kymriah和Yescarta分别用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤；2017年12月，美国的第一款基因治疗产品Luxturna被批准上市，用于治疗莱伯氏先天性黑蒙症；2019年2月，日本厚生劳动省在批准Kymriah的同时批准了本国公司AnGes生产的基因治疗产品Collategene（コラテジェン)[20]，用于治疗在标准药物治疗后无效的闭塞性动脉硬化症和血栓闭塞性脉管炎，这是被日本官方批准的第一款基因治疗产品；2019年5月，FDA批准Zolgensma用于治疗2岁以下儿童的脊髓性肌萎缩症，Zolgensma的定价为每剂212.5万美元，成为有史以来最昂贵的药物；2019年6月，欧盟委员会（EC）有条件批准蓝鸟生物的基因治疗产品Zynteglo上市，治疗12岁及以上患者的输血依赖型β地中海贫血。
4.基因疗法的近期研究概况
再生医学联盟（ARM）于5月初发布2019年第一季度的《全球再生医学季度数据报告》，报告称，截止一季度末，有372项基因治疗临床试验正在进行中，其中大多数（217项，58%）是II期研究、其次是I期研究（123项，33%）和III期研究（32项，9%）。这一数字相较2018年底增加了10个，与2018年一季度相比增长了17%[21]。目前获批于临床试验阶段的基因疗法大多数是针对罕见病症，ARM于3月28日发布的报告中统计了587项基因疗法和基因相关疗法的罕见病临床试验数据：其中425项临床试验是针对罕见癌症，包括血液系统恶性肿瘤，卵巢癌，胰腺癌，肺癌，胶质母细胞瘤等，30项试验是针对血液病，包括血友病，镰状细胞病，地中海贫血，范可尼贫血症等，23项试验是针对内分泌，代谢和遗传疾病，19项临床试验是针对眼病，其余罕见病试验数据详见图3。
图3:587项针对罕见病的临床试验统计
图片来源：https://alliancerm.org/wp-content/uploads/2019/03/ARM-Gene-Therapy-for-Rare-Disorders_FINAL.pdf
近期，有不少基因疗法项目或相关研究在技术上有重大进展，有望成为基因疗法新生代发展的突破口。2018年11月，美国贝勒医学院的Xander Wehrens博士及其同事们发表在《Circulation Research》上的一篇论文称，他们开发了一种有望阻止心脏性猝死的基因编辑疗法，在实验中，Wehrens和Lagor设计了AAV载体，将CRISPR/Cas9（AAV-CRISPR）运送到小鼠的心脏中，AAV-CRISPR被用来选择性地破坏R176Q CPVT小鼠模型中的RYR2突变基因，这种基因与心率突变高度相关，试验结果非常令人鼓舞：所有小鼠均未发生心率失常，也未出现其他不良反应[22]；2018年12月，来自特拉华大学的科学家在《Science Advances》上发文称，他们已经开发了一种新的基因载体，该载体利用巨核细胞微粒来运输质粒DNA和小型RNAs进入到造血干细胞中，这种巨核细胞微粒能在血液中天然循环[23]；2019年1月，一篇发布在《Brain》上的论文报告了荷兰神经科学研究所（NIN）和莱顿大学医学中心（LUMC）合作项目的成果，该项目通过将手术修复程序与基因治疗相结合，首次刺激了神经细胞的存活和长距离神经纤维的再生[24]；2019年2月，美国生物科技巨头AbbVie近日宣布与临床阶段基因治疗公司Voyager Therapeutics达成一项独家全球合作和选择权协议，开发和商业化靶向病理性α-突触核蛋白的载体化抗体疗法，治疗帕金森病和其他以错误折叠α-突触核蛋白异常积累为特征的疾病（突触核蛋白疾病）[25]；同于2019年2月，贝勒医学院的研究团队发表在《Cell》上的一篇文章称，17号染色体突变会导致Potocki-Lupski和Smith-Magenis综合征，并表明其他涉及染色体片段重复或缺失的病症可能是由类似的机制引起的[26]；2019年4月，《NEJM》发表上的一篇文章介绍了X-链接复合免疫缺陷（SCID-X1）基因疗法，该疗法由St.Jude设计，其机理是利用一个可以防止癌变的独特病毒载体将患者的细胞发生变异的IL2受体γ单位用正常基因替换，然后回输给患者，接受该疗法的患者都有了良好的反馈，8位婴儿患者平均跟踪16.4个月没有发现严重副作用，7位患者的CD3+、CD4+、NK细胞在三、四个月后正常，第八位患者也在追加一个剂量细胞疗法后恢复正常[27]。
5. 基因疗法领域投资现状及思考
5月20日，国际知名生物网站GEN列出了“2019年最有前途的25个基因疗法榜单”，除了已获EMA有条件批准的Zynteglo和已获FDA批准上市的Zolgensma之外，还有23个基因疗法都处于“正在进行或已申请第III期临床试验阶段”。这25种疗法涉及的适应症非常广泛，基本上可代表当前基因疗法的主流应用方向：有8种疗法用于癌症治疗领域，适应症包括宫颈癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、胶质瘤、肾细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌和乳腺癌等癌种；3种疗法用于心脑血管疾病治疗领域，适应症包括痛性糖尿病周围神经病、糖尿病慢性非愈合性缺血性足溃疡、严重肢体缺血、急性心肌梗塞、难治性心绞痛、心脏X综合征、充血性心力衰竭、烟雾病、脑缺血、射血分数降低等病症；其余14种则用于基因缺陷病治疗领域，适应症包括血友病A、血友病B、输血依赖性β地中海贫血、严重镰状细胞病、SMA、异染性脑白质营养不良（MLD）、Wiskott-Aldrich综合征（WAS）、腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷（ADA-SCID）、无脉络膜症、对护理无反应的持续性上皮缺陷（PED）、粘多糖病IIIA（MPS IIIA）、脑部肾上腺脑白质营养不良、莱伯氏先天性黑蒙症等。
图4：基因治疗公司的全球分布情况
图片来源：https://alliancerm.org/wp-content/uploads/2019/03/ARM-Gene-Therapy-for-Rare-Disorders_FINAL.pdf
经过二十余年的发展，全球从事基因治疗事业的公司已有400家，其中北美洲214家、欧洲（包括以色列）104家、亚洲73家、大洋洲7家、南美洲2家。近几年在基因治疗领域比较活跃的公司绝大多数集中在北美和欧洲，分别是：Applied Genetic Technologies Corp（AGTC）、AudentesTherapeutics、BioMarin Pharmaceutical、bluebird bio、NightstarTherapeutics、Sangamo Therapeutics、Spark Therapeutics、uniQure、VBL Therapeutics、GlaxoSmithKline、Avexis和Voyager Therapeutics。
近期医药巨头企业以收购公司的方式进军基因疗法领域的消息令人瞩目，也反应出了基因治疗领域内各个行业节点的投资风向：去年2月，凯特制药斥资31.5亿美元结盟Samgamo，借助后者的ZFN基因编辑技术用于开发新一代的CAR-T疗法；去年6月，诺华以87亿美元收购基因疗法公司AveXis，并获取其治疗脊髓性肌萎缩（SMA）的创新基因疗法；今年2月24日，罗氏控股宣布将以48亿美元（溢价122%）收购基因治疗公司Spark Therapeutics，后者在研的基因疗法主要针对遗传性眼病、血友病、溶酶体贮积症、以及神经退行性疾病等病症；随后的2月28日，Sarepta以1.5亿美元收购Myonexus，后者开发的基因疗法适用于5种类型的LGMD（LGMD2E、LGMD2D、LGMD2B、LGMD2C、LGMD2L），这是一种遗传性神经肌肉疾病；3月，Biogen将支付8.77亿美元（7.72亿欧元）购买Nightstar Therapeutics公司，收购将使Biogen控制临床阶段的眼科资产；4月，Catalent宣布以12亿美元收购Paragon Bioservices，后者是一家病毒载体开发和基因疗法制造公司，开发和制造用于基因治疗的腺相关病毒和慢病毒载体。由此可以看出，受资本热捧的基因治疗产品与医药监管部门的认可程度有较大关联，一些针对罕见病如运动神经元疾病、血液疾病和眼病的基因治疗产品比较容易受到巨头企业资本的青睐，安全性得到科学界广泛认可的ZFN基因编辑技术、腺相关病毒载体和慢病毒载体技术也得到了资本的扶持，而这些产品和技术都已经得到过医药监管部门程度不一的认可。
去年全球投资在基因治疗及相关领域的资金超过97亿美元，其中投在罕见病基因治疗领域的资金约为82亿美元，相比2017年分别上涨64%和39%[28]。EvaluatePharma在今年年初发布报告称，预计在未来6年内，将有多达60种基因疗法获得批准，这些基因疗法在2024年的销售额将达到146亿美元，约占全球医药总收入的1.2%[29]。但EvaluatePharma同时也指出，目前基因疗法市场化进展的最大阻碍是价格问题；以欧洲市场为例，2012年被EMA批准的Glybera由于过少的患者申请而迫使uniQure公司做出了放弃申请美国FDA批准上市的决定；2016年EMA批准的第二款基因治疗药物Strimvelis因其66.5万美元的价格再次让患者望而却步，2017年全年仅有两名患者申请了该疗法的使用；17年美国批准的Luxturna定价为85美元，最近由欧美批准的。然而，目前全球主要市场的政府机构还没有将这种昂贵的治疗手段纳入医保体系，保险公司也处于观望之中，费用问题一时间难以解决。
综上所述，在基因治疗领域，投资人可以采取以下三种投资策略：第一，把投资重心放在已经获得监管部门批准先例或支持态度的相关基因治疗产品和基因工程技术上，尤其要注意药监部门的监管政策风向或是药企巨头在开发类似病症产管线方面的动作；第二，重点关注一些在二、三期临床试验中对罕见病或常见病有突破性疗效的，且采用的基因工程技术安全性得到充分验证的疗法；第三，密切关注新型基因传输技术和基因编辑技术的研究动态，再从技术性能和应用前景的角度考虑，寻找资本准入和商业化开发的先机。此外，对于目前的基因治疗行业来说，其商业价值不在于售药带来的利润，而是通过借鉴基因疗法已经成功、安全地应用于罕见病的经验，将之推入常见病治疗领域，从而发挥其更大的社会价值，投资人也能够从中获得更多的商业回报。
参考文献：
[1]Collins F S, Gottlieb S. The next phase ofhuman gene-therapy oversight[J]. N Engl J Med, 2018, 379(15): 1393-1395
[2]https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/expedited-programs-regenerative-medicine-therapies-serious-conditions
[3]Munyon W, Kraiselburd E, Davis D, et al.Transfer of thymidine kinase to thymidine kinaseless L cells by infection withultraviolet-irradiated herpes simplex virus[J]. Journal of virology, 1971,7(6): 813-820.
[4]Merril C R, Geier M R, PETRICCIANI J C.Bacterial virus gene expression in human cells[J]. Nature, 1971, 233(5319):398.
[5]Lundstrom K. Viral vectors in gene therapy[J].diseases, 2018, 6(2): 42.
[6]Jackson D A, Symons R H, Berg P.Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of SimianVirus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and thegalactose operon of Escherichia coli[J]. Proceedings of the National Academy ofSciences, 1972, 69(10): 2904-2909.
[7]Gutschi S, Hermann W, Stenzl W, etal. Displacement of electrodes in pacemaker patients (author's transl)[J].Zentralblatt fur Chirurgie, 1979, 104(2): 100-104.
[8]Maniatis T, Kee S G, Efstratiadis A, et al.Amplification and characterization of a β-globin gene synthesized in vitro[J].Cell, 1976, 8(2): 163-182.
[9]Yanchinski S. Mice incorporate gene with engineered resistance[J]. NewScientist, 1980, 86(1205): 244.
[10]JonathanStrecker et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases,Science (2019). DOI: 10.1126/science.aax9181.
[11] https://www.sciencedaily.com/releases/2019/06/190612141309.htm
[12]Mali P, Yang L, Esvelt K M, et al. RNA-guidedhuman genome engineering via Cas9[J]. Science, 2013, 339(6121): 823-826.
[13]Tebas P, Stein D, Tang W W, et al. Gene editingof CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV[J]. New EnglandJournal of Medicine, 2014, 370(10): 901-910.
[14]李建军, 王添. 人类胚胎基因编辑研究引发的伦理争辩[J]. 科学与社会, 2016, 6(3): 32-41.
[15]Hoban M D, Cost G J, Mendel M C, et al.Correction of the sickle cell disease mutation in human hematopoieticstem/progenitor cells[J]. Blood, 2015, 125(17): 2597-2604.
[16] Cyranoski D. Chinese scientists to pioneer first humanCRISPR trial. Nature, 2016, 535(7613): 476–477.
[17] http://www.medsci.cn/article/show_article.do?id=ea9b839562a
[18]Chadwick A C, Wang X, Musunuru K. In vivo baseediting of PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) as atherapeutic alternative to genome editing[J]. Arteriosclerosis, thrombosis, andvascular biology, 2017, 37(9): 1741-1747.
[19]https://www.sciencemag.org/news/2019/02/crispr-offshoot-still-makes-mistakes-editing-dna-raising-concerns-about-its-medical-use
[20]https://www.mixonline.jp/tabid55.html?artid=67231
[21] http://news.bioon.com/article/6738644.html
[22] http://news.bioon.com/article/6729783.html
[23] http://news.bioon.com/article/6730754.html
[24] http://news.bioon.com/article/6732814.html
[25] http://news.bioon.com/article/6734316.html
[26] Megabase LengthHypermutation Accompanies Human Structural Variation at 17p11.2. Cell(2019). DOI: 10.1016/j.cell.2019.01.045
[27] http://news.bioon.com/article/6737038.html
[28]https://alliancerm.org/wp-content/uploads/2019/03/ARM-Gene-Therapy-for-Rare-Disorders_FINAL.pdf
[29]https://www.evaluate.com/vantage/articles/analysis/vantage-points/gene-therapy-how-much-will-it-cost-patients
相关文章推荐：