CELL |CRISPR系统+腺相关病毒载体实现体内基因编辑
来源：病毒学界
近日，马萨诸塞大学医学院高光坪团队与麻省理工学院张锋在国际顶级期刊CELL上发表综述，题为“CRISPR-Based Therapeutic Genome Editing: Strategies and In Vivo Delivery by AAV Vectors”。文章阐述了利用腺相关病毒（AAV）载体递送CRISPR在人体内编辑基因治疗疾病的策略，深入讨论了CRISPR治疗广泛应用所面临的挑战，以及持续的研究和技术进步给该领域带来的革命性突破。
CRISPR技术作为新兴的基因编辑工具，极大推动了基础研究和疾病治疗，将CRISPR/Cas直接用于人体，为多种疾病的治疗提供了希望。尽管CRISPR工具箱能够实现从DNA到RNA、从编辑到基因表达调控的多种操作，递送始终是一个问题。目前，腺相关病毒载体是体内基因治疗递送的主要平台。AAV安全、便捷，能够将单链DNA载体基因组递送至各种组织和细胞类型，并且在多种给药方式中仅具有弱免疫原性。尽管载体基因组在宿主细胞内基本上保持游离状态，但通过多联体和环化可以稳定基因组以介导分裂后细胞中的长期转基因表达，从而产生持久的治疗效果。AAV载体在向疾病动物模型和患者递送基因疗法方面已取得成功，推动了它们用于体内递送CRISPR疗法。
传统的CRISPR基因编辑通过Cas蛋白引发双链断裂，进而通过非末端连接实现基因沉默，或根据预测的插入缺失进行校正，通过同源重组系统精确突变。通过将CRISPR系统与腺相关病毒载体结合，腺相关病毒载体可以整合用于同源重组介导基因插入、同源重组独立的靶基因插入等元件，实现靶向基因校正；腺相关病毒载体也可以通过向特定组织递送Cas蛋白，一对靶点独立的sgRNA，可以实现大片段基因切除；携带Cas13的AAV载体可以通过靶向RNA实现持久的体内治疗效果。
此外，改造CRISPR/Cas系统，通过Cas蛋白突变体与效应蛋白偶联，实现特定基因的表达调控。通过腺相关病毒载体承载dCas9-KRAB/dCas9-VP64可以分别实现转录水平的下调、增强；通过递送dCas蛋白结合组蛋白修饰酶、DNA(去)甲基化酶实现表观遗传水平的调节；腺相关病毒载体也可能与base editor、prime editor结合发挥精确基因编辑的功能。
AAV可用于离体递送，目前离体递送技术已相对成熟，在将编辑的细胞回输患者体内前，可以确保基因编辑的效率和准确性，安全性高，且不受宿主免疫限制。然而易于分离、操作的细胞类型有限，体内编辑具有更广泛的应用。AAV载体已被广泛用于体内基因治疗递送，在关于疾病模型许多研究中已经报道了使用AAV进行基于CRISPR的基因组编辑治疗的体内递送，安全性较高，关键的问题在于包装CRISPR大小限制以及脱靶效应。为减小CRISPR/Cas系统的大小，便于腺相关病毒承载，可以选择相对较小的Cas蛋白，采用双重腺相关病毒载体分别携带CRISPR/Cas不同基因片段，或者通过内含肽分开在蛋白质水平上重建。而为了降低脱靶效应，可以借助诱导表达系统、自切割AAV-CRISPR系统、局限特定组织空间、特定位点AAV载体整合。
CRISPR-腺相关病毒系统依然面临许多问题，例如针对AAV衣壳和载体诱导的免疫应答的预先存在的免疫力，递送效率和特异性，以及AAV载体的生产等，同时脱靶效应、过度的靶向效应、基因重排等也限制了该系统的应用，但是随着我们对细胞过程的深入了解，以及各类新技术的发展，将使我们更好应用CRISPR/AAV系统，治疗各类疾病。
以CRISPR/Cas为前沿的生物化学领域与AAV载体病毒学领域的共同发展，将更好服务于新兴的分子疗法。
本期编辑：Reynard Fox