查看原文
其他

基因治疗载体AAV引起的固有免疫应答概述

GT 细胞与基因治疗领域 2022-06-21

以AAV为载体的体内基因治疗数据,尤其是临床试验数据提示AAV载体在低剂量给药时,免疫反应不强烈,但在高剂量给药时可能引起较为强烈的炎症免疫反应,对组织器官表现出毒性效应(也有报道称发现独立于炎症之外的毒性,在此本文不予以讨论,后续我们会有专门文章作讨论。)。此外,针对AAV载体及其治疗基因产物的免疫反应还会抑制其药效。因此,有必要对AAV感染的免疫应答包括固有免疫与适应性性免疫应答做深入研究,指导最佳的药物策略或方案,一方面确保AAV基因治疗的安全性,一方面提高AAV基因药物的药效。

当AAV载体进入人体细胞后,体内抗原提呈细胞(例如DC、巨噬细胞等)经模式识别受体(例如TLR9、TLR2等)检测识别到AAV载体上的病原体相关分子模式,激活下游的相关信号通路,活化NF-κB(nuclear factor kB)、IRF(IFN-regulatory factor)等转录因子,它们分别在诱导促炎证因子及I型IFN方面发挥核心作用,上述信号通路激活诱导的细胞因子可刺激抗原提呈细胞的成熟,上调MHC及其一些共刺激因子的表达。当抗原提呈细胞迁移至淋巴结后,将AAV载体抗原肽提呈给淋巴细胞,致敏抗原特异性T细胞,激活特异性免疫反应。

模式识别受体

Toll 样受体(TLR)是一类跨膜受体,参与机体免疫。哺乳动物中已发现Toll样受体家族成员有11个。其中研究较为清楚的是TLR2,TLR4,TLR5和TLR9。TLR如同固有免疫的眼睛,监视与识别各种不同的病原体相关分子模式(PAMP)。有些TLR家族成员不但可识别外源的病原体等异物,还可识别内源性物质及降解物。TLR9是识别CpGDNA的模式识别受体,它可通过激活单核/吞噬细胞系统信号转导,活化NF―κB、AP-1,从而大量释放TNF-α、IL-1、IL-6和IL.12等多种前炎症细胞因子,引起急性炎症反应、脓毒症甚至休克。TLR2是Toll样家族中识别配体范围最大的一类Toll样受体,能够识别包括脂蛋白,脂多肽,脂壁酸(LTA) 阿拉伯甘聚糖(LAM)及酵母多糖等在内的多种配体,激活后的TLR2可以在免疫系统中发挥重要作用,引发特异性免疫反应。TLR对配体的识别,不同类型的TLRs可以组合,从而识别不同的PAMPs,如TLR7可能同TLR9组合来介导CpG激活免疫细胞。其中TLR4/TLR4和TLR9/TLR9是以同源二聚体的形式进行;而TLR2/TLR4、TLR2/TLR6和TLR7/TLR8为异源二聚体,还有的二聚体中有一个亚单位尚未确定,如TLR3/TLR、TLR5/TLR。

图1. TLR及其信号通路(Zhao et al, Frontiers in immunology, 2014) 
血液中的浆细胞样DC(pDC)、肝脏中的库普弗细胞等细胞的TLR9是识别AAV基因组核酸(尤其是未甲基化CpG DNA)的主要模式识别受体,有研究人员用单链AAV载体体外刺激小鼠来源的pDC,结果在其培养上清中检测到了I型IFN的增加。采用人外周单个核细胞(PBMC)得到了类似的结果。临床前研究也证实了TLR9-MyD88信号通路活化是靶向肝脏和肌肉等AAV基因疗法中免疫激活的原因之一。单链AAV载体刺激TLR9敲除小鼠的pDC,未表现出IFN分泌的增加。采用TLR9抑制剂处理人pDC后,单链AAV的刺激便不能增加IFN的分泌。此外,研究表明AAV载体刺激pDC分泌IFN的效应与AAV载体血清型及装载的基因元件类型无关。以单链AAV载体刺激小鼠的巨噬细胞、库普弗细胞、人单核细胞等,未见I型IFN的分泌增加。上述结果表明TLR9是pDC内识别AAV载体的病原体模式识别受体。pDC是体内产生I型IFN最重要的细胞,其产生I型IFN的效率是其他细胞的一百倍以上。近期JL Shirley et al发文称:I型IFN是诱导特异性免疫中抗AAV衣壳CD8+T细胞反应的重要因素,固有免疫细胞pDC与cDC协同作用激活特异性免疫反应中的CD8+ T细胞免疫反应,其中TLR9对于pDC是必须的,对于cDC来说,TLR9显得不重要,其中pDC通过TLR9监测AAV载体的入侵,cDC负责AAV衣壳多肽抗原的提呈(见图2)。TLR9敲除小鼠通过过继输注野生型小鼠pDC可恢复其针对AAV衣壳的CD8+ T细胞免疫反应。上述研究表明pDC中TLR9固有免疫信号通路是后续适应性细胞免疫CD8+ T激活的重要因素。

图2 固有免疫细胞pDC与cDC协同激活CD8+ T特异性细胞免疫反应(JL Shirley et al, Molecular Therapy, 2020)
小鼠体内实验结果显示经门静脉注射单链AAV载体后,其肝内MyD88、I型IFN、炎性细胞因子等表达了增加了3~4倍。自身互补性AAV诱导固有免疫反应比单链AAV强烈很多,其诱导增加的炎症因子种类更多。TLR敲除的小鼠被scAAV诱导的固有免疫反应相比野生型小鼠低很多,其中IL-6、MCP-1和TNF-α几乎与未给药组一致。
研究发现不含核酸成分的空壳,也可诱导肝脏产生炎性因子,说明存在可以识别AAV载体衣壳模式识别受体。早期人们发现TLR2可以识别细菌及支原体的酰基脂蛋白,后发现病毒衣壳(例如腺病毒衣壳)也可以被TLR2识别。加上AAV空衣壳可以诱导肝脏TLR2表达增加,人们考虑到TLR2也许是AAV衣壳的模式识别受体。以AAV空衣壳刺激稳转TLR2的293细胞系(HEK293/hTLR2-CD14),其下游报告基因表达量显著增加,而野生型293细胞其下游报告基因表达量与刺激前相比无变化。表明TLR2是AAV衣壳上模式的识别受体。以AAV空衣壳刺激肝脏库普弗细胞,其TNF-α、IL-1β等炎性因子表达量增加。若以抗TLR2的抗体处理库普弗细胞后再用AAV空衣壳刺激,则表达炎性因子的水平明显被抑制,肝窦内皮细胞的反应与肝脏库普弗细胞类似。说明在肝脏内这两种细胞可以被AAV载体经TLR2途径激活肝脏内固有免疫反应。
除了AAV基因组及其衣壳诱导的固有免疫反应外,近期研究结果显示,其dsRNA也许作为病原体相关模式参与了针对AAV载体的固有免疫,这也就解释了一些临床实验中给药AAV载体数周后才出的现针对AAV载体的特异性细胞免疫反应。研究显示AAV载体的ITR可作为启动子启动dsRNA的表达,dsRNA可以激活MDA5(melanoma differentiation-associated gene-5),促进Ⅰ型IFN的表达。MDA5是胞浆内核酸受体,与病原相关分子模式(PAMPs)相结合,特异性地识别较长的双链RNA,通过自身级联激活和招募结构域(CARD)与接头蛋白CARD同源相互作用之后,与接头蛋白线粒体连接蛋白(MAVS)结合,相互作用后会导致RIG-Ⅰ样受体(RLR)在内膜上重新定位,一边招募来TRAF2/TRAF6活化IKK激酶复合物,从而激活转录因子NF-κB;另一边招募来TRAF3和TBK1,从而促进IRF3的磷酸化激活,活化后的转录因子NF-κB及IRF会进入细胞核,共同协作促进Ⅰ型IFN基因的表达。体外抑制MDA5活性,可降低Ⅰ型IFN的表达,提高AAV的转基因表达率。
IRF信号通路
IRF作为转录因子,可以与I型IFN的病毒诱导类增强子元件结合,并诱导I型IFN的表达。I型IFN可诱导数百个与抗病毒相关的基因表达,敲除I型IFN的小鼠很易受到病毒感染,表明IRF信号通路在抗病毒免疫反应方面的重要性。
根据其它病毒诱导pDC分泌I型IFN研究结果推测可AAV载体激活TLR9-MyD88-IRF信号通路大致过程。AAV载体经pDC内吞或感染进入其胞内,病毒的未甲基化的CpG DNA被细胞内涵体膜上TLR9识别结合,启动TLR9-MyD88-IRF信号通路,MyD88通过同嗜相互作用招募MyD88和IRAK家族成员,IRAK激活下游的IRF-7,活化的IRF-7进入细胞核,与干扰素基因上的相关调控元件结合,激活I型IFN基因的表达。
NF-κB信号通路
核因子-κB (NF-κB)/Rel 蛋白包括 NF-κB2 p52/p100、NF-κB1 p50/p105、c-Rel、RelA/p65 和 RelB。这些蛋白起到二聚化转录因子的作用,可调节基因表达,并可影响到各种不同的生物学过程,包括先天和适应性免疫、炎症、应激反应、B 细胞发育和淋巴器官形成。在经典(典型)信号通路中,NF-κB/Rel 蛋白与 IκB 蛋白结合并受到其抑制。促炎细胞因子、脂多糖 (LPS) 、生长因子以及抗原受体激活一个 IKK 复合体(IKKβ、IKKα 和 NEMO),后者将 IκB 蛋白磷酸化。IκB 磷酸化导致其自身泛素化以及蛋白酶体降解,释放 NF-κB/Rel 复合体。活性 NF-κB/Rel 复合体进一步由翻译后修饰(磷酸化、乙酰化、糖基化)作用激活,并转运入胞核,在核内单独或联合其他转录因子,诱导靶标基因表达。细胞表面的TLR2与AAV衣壳上病原体相关模式或细胞内涵体上的TLR9被AAV基因病原体相关模式结合后,激活MyD88,招募相关蛋白,产生信号级联反应,最终导致 IκB磷酸化,释放NF-κB,游离的NF-κB入核,与相应的DNA元件结合位点结合,激活靶基因的表达。scAAV尾静脉给药2h后即可在小鼠肝脏检出NF-κB亚基表达增加,同时参与此信号通路的TLR2、TLR9、MyD88、炎性因子表达均增加。若给药前1天,注射小鼠抑制IKKβ与IKKα活性的药物,即可降低此信号通路激活所引起的细胞因子的表达,表明AAV载体引起的肝脏炎性因子的瞬时增加与NF-κB信号通路相关。
目前在临床AAV基因治疗中免疫抑制药物主要采用类固醇药物。以糖皮质激素为例,糖皮质激素进入细胞内便与其相应的受体结合形成复合物,此复合物能够向细胞核移行,并作为转录因子促进核因子κB抑制蛋白基因(IκB)表达,生成IκB分子。NF-κB虽然是与白介素-6(IL-6)等多种细胞因子和免疫球蛋白的基因表达有密切关系的转录因子,但在细胞中仍以与IκB分子结合的状态存在。在蛋白激酶的作用下,IκB分子磷酸化后从NF-κB解离,NF-κB向细胞核移行诱导相关炎症免疫基因表达。由于IκB分子是NF-κB抑制因子,大量表达后能够抑制NF-κB的活性,进而减少了免疫细胞产生细胞因子,T细胞激活受到影响。
除了上述激素药物外,还有多种固有免疫抑制策略被用于临床及临床前研究(载体改造、抗体靶向、蛋白酶体抑制剂等)。早期固有免疫反应的强弱是影响整个免疫反应的关键因素,因此早期固有免疫反应抑制策略,有助于降低AAV基因治疗炎症副反应,抑制针对AAV载体的适应性免疫反应,对提高AAV基因治疗的安全性及长期有效性具有重要意义。
参考资料:

1. Verdera, Helena Costa, Klaudia Kuranda, and Federico Mingozzi. "AAV vector immunogenicity in humans: A long journey to successful gene transfer." Molecular Therapy 28.3 (2020): 723-746.

2. Shirley, Jamie L., et al. "Type I IFN sensing by cDCs and CD4+ T cell help are both requisite for cross-priming of AAV capsid-specific CD8+ T cells." Molecular Therapy 28.3 (2020): 758-770.

3. Ronzitti, Giuseppe, David-Alexandre Gross, and Federico Mingozzi. "Human Immune Responses to Adeno-Associated Virus (AAV) Vectors." Frontiers in Immunology 11 (2020).

4. Shirley JL, Keeler GD, Sherman A, Zolotukhin I, Markusic DM, Hoffman BE, et al. Type I IFN sensing by cDCs and CD4(+) T cell help are both requisite for cross-priming of AAV capsid-specific CD8(+) T Cells. Mol Ther. (2019) 28:758–70. 

5.杨秋媚. "常用免疫抑制剂及其免疫抑制机理概述." 生物学教学 44.7 (2019): 2-3.

6. Shao, Wenwei, et al. "Double-stranded RNA innate immune response activation from long-term adeno-associated virus vector transduction." JCI insight 3.12 (2018).

7. Rogers, Geoffrey L., et al. "Plasmacytoid and conventional dendritic cells cooperate in crosspriming AAV capsid-specific CD8+ T cells." Blood, The Journal of the American Society of Hematology 129.24 (2017): 3184-3195.

8. Berns, Kenneth I., and Nicholas Muzyczka. "AAV: an overview of unanswered questions." Human gene therapy 28.4 (2017): 308-313.

9. 刘欢欢, et al. "MDA5 在先天性免疫抗病毒作用中的研究进展." 中国畜牧兽医 42.1 (2015): 230-233.

10. Zhao, Shu, et al. "Toll-like receptors and prostate cancer." Frontiers in immunology 5 (2014): 352.

11. 许瑞安,, et al. 腺相关病毒―从病毒到临床[M]. 2014.

12. Hösel M, Broxtermann M, Janicki H, Esser K, Arzberger S, Hartmann P, et al. Toll-like receptor 2-mediated innate immune response in human nonparenchymal liver cells toward adeno-associated viral vectors. Hepatology. (2012) 55:287–97.

13. Trinchieri, Giorgio, and Alan Sher. "Cooperation of Toll-like receptor signals in innate immune defence." Nature Reviews Immunology 7.3 (2007): 179-190.

14.https://www.cst-c.com.cn/contents/science-cst-pathways-immunology-inflammation/nf-b-signaling/pathways-nfkb

15. Trinchieri G, Sher A. Cooperation of Toll-like receptor signals in innate immune defence. Nat Rev Immunol. (2007) 7:179–90. 

相关文章推荐:
新冠肺炎大流行迫使一些基因治疗公司转变战略
近期基因编辑研究领域重磅级文章解读
基因重组控制技术获突破
高剂量AAV载体引起的炎症免疫毒性概述
胎儿血红蛋白重现,重型地贫患者成功脱离输血
湘雅医院...发布线粒体病基因治疗最新成果
华东师大科学家实现光控基因编辑



您可能也对以下帖子感兴趣

文章有问题?点此查看未经处理的缓存