如何将大象放进冰箱-突破AAV包装容量限制的策略：二元AAV载体系统

撰文｜向阳屯铁匠

编辑排版｜张晓敏

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）是人类迄今为止发现的最简单的一类单链DNA缺陷型病毒。由于AAV免疫原性低，几乎无致病性并且又有着广泛的宿主范围，因此它作为基因治疗的明星载体已经被各个药业公司寄予厚望。然而，AAV简单的基因组结构给研究人员提供了在设计上极大便利的同时，也给其套上了一副沉重的枷锁：AAV只能携带大约4.7kb的外源基因片段。与目前依旧热门的基因治疗载体例如腺病毒（外源基因容量~37kb），逆转录病毒（外源基因容量<8kb）或者慢病毒（外源基因容量<5kb）相比，AAV的容量实在是太小。两段145bp的ITRs再加上启动子、操纵原件和poly-A，留给目的基因的空余位置往往是捉襟见肘。为了突破AAV在包装容量上的限制，许多实验室已经作出了非常巧妙的设计：

Oversized AAV Vectors 过载的AAV载体

在2005-2013年前后，几个实验室试图将一些远大于野生型AAV承载容量的巨大外源DNA片段（abca4~8.9kb，dysferlin~7.5kb ）包装到AAV颗粒中，并在体外细胞和实验动物体内都检测到了外源基因的表达。然而经过研究发现，这些大的外源DNA片段并没有被完整的包装到AAV颗粒内。取而代之的则是在病毒制备过程中，这些DNA序列被片段化并被包装到了不同的AAV颗粒中。这些混合的病毒基因组在细胞内进行了整合重建，并且启动了完整的外源基因序列的表达。因此在本质上，Oversized AAV Vectors 是利用了多个AAV来介导外源的DNA传递（dual AAV vector delivery）。基于这个原理，很多实验室开发了更高效的二元AAV载体系统（Dual AAV Vectors）。

Dual AAV Vectors 二元AAV载体

在二元AAV载体系统当中，巨大的外源基因被分割成两段并被包装到不同的AAV颗粒内。通过对同一细胞的共转化，外源基因片段可以在目标细胞内重新组装、转录以及表达。在理想的情况下，二元的AAV载体系统可以将外源基因承载容量扩充到9kb。基于不同的组装原理，二元的AAV载体系统又可以细分为Overlapping Dual AAV Vectors (重叠式二元AAV载体)、Trans-Splicing Dual AAV Vectors（反式剪接二元AAV载体）、Hybrid Dual AAV Vectors（混合式二元AAV载体）、Post-transcription-splicing Dual AAV Vectors（转录后剪接的二元AAV载体）和Sequential homologous recombination mediated Dual AAV Vectors（依赖于连续同源重组的二元AAV载体）

（1）.Overlapping Dual AAV Vectors重叠式二元AAV载体

在Overlapping Dual AAV Vectors 中，外源基因被分割成两段并放入两个AAV基因组当中。这两个基因片段含有大概400-2000个碱基长度的重叠区域。在被共感染的细胞内，这两个AAV基因组会发生同源重组，并产生含有完整外源基因的表达框，从而突破了AAV承载能力的限制。这种方法的优点是设计简单并且不会引入除待表达基因以外的任何基因序列。但是由于这个策略完全依赖于在宿主细胞内由重叠区域介导的同源重组，因此它的重建效率低，并且相当不稳定，重复性差。

Fig 1. Overlapping Dual AAV Vectors重叠式二元AAV载体

（2）. Trans-Splicing Dual AAV Vectors反式剪接二元AAV载体

反式剪接二元AAV载体的作用方式主要是基于AAV的ITRs可以天然形成头尾结合连体结构（tail-to-head concatemerization）的能力。在这种载体构建策略中，两个AAV载体分别携带有一半的目标基因序列，并且这两段基因序列并不重叠。编码目的蛋白N端序列的AAV基因组的3’端，含有一段剪切供体splice donor (SD)信号；相应的，编码目的蛋白C端序列的AAV基因组的5’端，含有一段剪受体splice acceptor (SA)信号。在non‐homologous end joining机制的作用下，头尾结合的两个AAV序列连接在一起。AAV携带的启动子起始了含有两段目标序列、ITRs、SD信号与SA信号的前体mRNA的转录。在转录完成后，反式剪接机制在这条前体mRNA上切割下了ITRs、SD信号与SA信号，从而得到一条仅含有目标序列的成熟mRNA。经过头对头的验证，反式剪接二元AAV载体的表达效率比重叠式二元AAV载体高出了12倍。然而AAV连体结构形成的困难与成熟mRNA积累的缓慢，仍然限制了这种方法的最终效率。

Fig 2. Trans-Splicing Dual AAV Vectors反式剪接二元AAV载体

（3）. Hybrid Dual AAV Vectors混合式二元AAV载体

为了提高单纯依赖于AAV反式剪接的二元载体表达效率，科研人员又设计了一种混合式的二元AAV载体。在混合式二元AAV载体中，两段77bp~1kb的同源序列被分别插入到一个AAV的SD信号与3’ ITR之间，以及另一个AAV的5’ ITR与SA信号之间。这样最终转录框的重建既可以像单纯的反式剪接二元AAV载体一样，依赖于ITRs与non‐homologous end joining，也可以依赖于两段同源序列介导的同源重组，从而提高重建含有SD信号、SA信号的目标序列的效率。目前alkaline phosphatase重组序列和F1 phage 重组序列都有被应用到这种载体当中，从而使同源重组不受目标外源基因序列影响，提高重组效率。

Fig 3. Hybrid Dual AAV Vectors混合式二元AAV载体

（4）. Post-transcription-splicing Dual AAV Vectors转录后剪接的二元AAV载体

有的二元AAV载体的外源基因表达依赖于在转录结束之后的剪接，即在mRNA水平或者多肽水平上的剪接。这类的AAV载体同样将目标序列分隔在两个AAV病毒颗粒之中，但与反式剪接二元AAV载体不同的是，这两个AAV基因组序列都含有一个独立的启动子。目标基因N-端序列的3’端和C-端序列5‘端’会被插入同源序列-SD/SA序列混合体，或者N/C-split-inteins。因此两段前体mRNA会被剪接成一条成熟的mRNA从而在宿主细胞中表达目的蛋白；或者两段多肽会完成剪接，从而形成一个有活性的蛋白。

Fig 4. Post-transcription-splicing Dual AAV Vectors转录后剪接的二元AAV载体

（5）. Sequential homologous recombination mediated Dual AAV Vectors依赖于连续同源重组的二元AAV载体

目前来说，依赖于连续同源重组的二元AAV载体并不常见。例如Rasmus等人利用CRISPR技术，在目标序列的靶点上进行定点切割从而产生特定的DSB。由于第一个AAV载体中含有与目标序列相同的两段同源臂，从而可以将AAV载体上位于两段同源臂之间的外源基因表达框的第一部分通过同源重组，特异性地插入目标位置。在第二轮CRISPR介导的目标序列切割完成后，第二个AAV载体再通过连续的同源重组，将外源基因表达框的第二部分定点插入在表达框第一部分的下游。这种方法完全依赖于细胞内的DSB修复系统中的homology directed repairs，如果该系统中的non-homologous end joining (NHEJ)介入，则会导致整个插入过程的失败。对基因编辑系统的依赖，也同样限制了该技术的发展。

Fig 5. Sequential homologous recombination mediated Dual AAV Vectors依赖于连续同源重组的二元AAV载体

目前基因治疗领域已经发展的如火如荼，AAV载体平台的研发也被各个公司推入正轨。随着新手段的成功应用，如何高效的突破AAV 4.7kb容量限制的难题最终会被逐渐解决，体格庞大的大象也终将会被放进小小的冰箱。

注：本文主要内容基于以下reviews与blog：

1. Tornabene, P., & Trapani, I. (2020). Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes?. Human gene therapy, 31(1-2), 47-56.

2. Trapani, I. (2019). Adeno-associated viral vectors as a tool for large gene delivery to the retina. Genes, 10(4), 287.

3. Trapani, I., Tornabene, P., & Auricchio, A. (2020). Large gene delivery to the retina with AAV vectors: are we there yet?. Gene Therapy, 1-3.

4. Four Ways to Package Transgenes That Exceed the Size Limit of Adeno-associated Virus By Beth Kenkel https://blog.addgene.org/four-ways-to-package-transgenes-that-exceed-the-size-limit-of-adeno-associated-virus

References：

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2.Hirsch, M. L. et al. Oversized AAV transductifon is mediated via a DNA-PKcs-independent, Rad51C-dependent repair pathway. Mol. Ther. (2013) doi:10.1038/mt.2013.184.

3.Chamberlain, K., Riyad, J. M. & Weber, T. Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids. Human Gene Therapy Methods (2016) doi:10.1089/hgtb.2015.140.

4.Duan, D., Yue, Y. & Engelhardt, J. F. Expanding AAV packaging capacity with Trans-splicing or overlapping vectors: A quantitative comparison. Mol. Ther. (2001) doi:10.1006/mthe.2001.0456.

5.Yang, J. et al. Concatamerization of Adeno-Associated Virus Circular Genomes Occurs through Intermolecular Recombination. J. Virol. (1999) doi:10.1128/jvi.73.11.9468-9477.1999.

6.Lai, Y. et al. Efficient in vivo gene expression by trans-splicing adeno-associated viral vectors. Nat. Biotechnol. (2005) doi:10.1038/nbt1153.

7.Al‐Moyed, H. et al. A dual‐AAV approach restores fast exocytosis and partially rescues auditory function in deaf otoferlin knock‐out mice. EMBO Mol. Med. (2019) doi:10.15252/emmm.201809396.

8.Xu, Z. et al. Trans-Splicing Adeno-Associated Viral Vector-Mediated Gene Therapy Is Limited by the Accumulation of Spliced mRNA but Not by Dual Vector Coinfection Efficiency. Hum. Gene Ther. (2004) doi:10.1089/hum.2004.15.896.

9.Trapani, I. et al. Effective delivery of large genes to the retina by dual AAV vectors. EMBO Mol. Med. (2014) doi:10.1002/emmm.201302948.

10.Akil, O. et al. Dual AAV-mediated gene therapy restores hearing in a DFNB9 mouse model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2019) doi:10.1073/pnas.1817537116.

11.Bak, R. O. & Porteus, M. H. CRISPR-Mediated Integration of Large Gene Cassettes Using AAV Donor Vectors. Cell Rep. (2017) doi:10.1016/j.celrep.2017.06.064.

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