作为原核生物抵御病毒入侵的重要免疫武器，CRISPR系统保护着细菌经历了漫长的演化岁月。而随着科学家对CRISPR系统研究的深入，各种基于CRISPR的DNA、RNA编辑工具和基因表达调控工具被逐渐开发与完善，并被大家期许将会在许多遗传性疾病的基因治疗中大展拳脚。小编今天会基于几篇重要的综述（高光坪教授与张峰教授的CRISPR-Based Therapeutic Genome Editing：Strategies and In Vivo Delivery by AAV Vectors，以及Thomas Gaj 的Next-Generation CRISPR Technologies and Their Applications in Gene and Cell Therapy等）带大家深入了解下目前CRISPR技术在基因治疗中的应用。
（1）利用非同源性末端接合（Non-homologous end joining，NHEJ）对目标基因进行破坏。作为人体细胞中最活跃的DNA修复机制，非同源性末端接合承担了大部分由CRISPR蛋白切割所引发的DNA双链断裂DSB的修复工作（Fig 1.）。在NHEJ对DSB粘合的过程中，Ku70/Ku80异二聚体会结合到断裂的DNA末端，DNA-PKcs分子被招募并与DNA结合。双链末端在被加工后，会由DNA连接酶IV/XRcc4进行连接修复。这个修复的过程会产生indel现象（碱基插入或删除），两个DNA末端间的碱基插入或删除会导致目标蛋白出现读码框内的移码突变或者外显子跳读，进而致使蛋白翻译失败。于是科学家可以通过利用这一机制，特异性地破坏目标基因的正常表达。例如在2015年，Ran等人（Ran et al., 2015）向小鼠体内注射了包装有Staphylococcus aureus (SaCas9) CRISPR基因编辑系统的AAV（Thyroxine-binding globulin（TBG）promoter-SaCas9-bGHpA-sgRNA-U6 promoter）。这一系统在小鼠体内可以特异性地破坏可以降解肝细胞表面LDL受体的PCSK9基因。在注射AAV-SaCas9一周后，科研人员在肝细胞中检测到超过40%的PCSK9基因已经被indel机制破坏，血液中PCSK9蛋白的含量比注射前减少了90%，进而总胆固醇的含量也下降了40%。小鼠则未表现出明显的炎症反应或免疫反应的迹象。相类似的，由于CCR5是HIV感染细胞过程中的一个重要的细胞受体，对CCR5蛋白表达进行干扰，有可能有阻止HIV感染细胞的进程。因此Xu等人（Xu et al., 2019b;）利用非病毒的传递方式将CRISPR-Cas9系统转染到HSPCs（CD34+）细胞中，并在体外对CCR5基因进行了编辑。基因测序结果显示，目的基因CCR5发生indel的效率达到17.8%。但令人遗憾的是，将经过基因编辑的细胞移植到病人体内后，抵抗HIV病毒感染的能力表现不佳，不过携带有CCR5突变的细胞在病人体内存活达19个月。这一结果也为今后的细胞离体编辑实验，提供了指导。Fig 1. Therapeutic Editing Strategies Based on Nuclease Activity
（2）利用同源重组修复（Homology directed repair，HDR）对目标基因进行精确编辑。同源重组修复是CRISPR系统向目标基因引入特定DNA序列的主要修复途径（Fig 1.）。然而HDR在人体细胞中的效率非常低，尤其是在肌细胞和神经细胞这样的post-mitotic cells中，这一点大大限制了CRISPR矫正基因的治疗能力。此外，利用HDR进行基因编辑需要在向目标细胞递送CRISPR系统的同时，再递送一份用于修复用的含同源臂以及修复序列的DNA模板。这又使基于此原理的基因治疗的复杂程度大大增加。但从最终的效果来看，利用同源重组修复来对目标基因进行精确编辑仍是一种强大的治疗策略，尤其是当编辑少量细胞就可以达到可观的治疗效果或者编辑目标位于可再生组织的情况下。例如Ⅰ型遗传性酪氨酸血症，这是一种由于肝细胞中FAH基因发生突变所导致的代谢疾病。Yin等人（Yin et al., 2014）向酪氨酸血症模型小鼠注射了携带有CRISPR-Cas9系统的质粒（U6 promoter sgRNA-CBh promoter 3×FLAG Cas9）和FAH基因修复模板ssDNA。在注射完成的33天后，大约有1/250的肝细胞中FAH基因被修复，小鼠的酪氨酸血症症状也有相应缓解。这个例子是使用HDR的方法，将突变的目标基因按照提供的DNA模板进行修复。同样的，当用于修复的DNA模板中含有外源基因的表达组件时，也可以利用HDR将外源基因精确地插入到基因组的目标位置上。这里比较有趣的例子就是利用CRISPR技术，精确构建CAR-T细胞。目前CAR-T细胞常规的构建方法，都是通过慢病毒或者逆转录病毒，将CAR基因随机插入到T细胞的基因组中。但是这种插入位点的随机性，会有不可确定的潜在的遗传副作用。而通过CRISPR+HDR的方法，则可以将CAR特异性插入到T细胞的目标基因例如Programmed cell death protein 1（PD-1）、T-cell receptor a constant (TRAC)等的位置上。这样既可以降低由PD-1蛋白表达所产生的免疫抑制效应，又可以利用新插入的CAR指导T细胞识别表达了肿瘤抗原的癌细胞，从而使CAR-T的治疗更安全、更有效，一举两得。天然的CRISPR系统在细菌体内是可以对多个位点进行编辑的，科学家则利用这一特性达到了对DNA大片段进行编辑的效果（Fig 1.）。通过引入靶标于目标片段上下游两个不同靶点的sgRNA，多到数兆的碱基对都可以从基因组上的目标位置中被切割下来。这种编辑手段，可以在特异性切割突变基因中一个或多个外显子片段的同时保留该基因原有的表达框，从而使剩余具有活性的蛋白正常表达。目前该技术非常有希望治愈的疾病就是杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）。杜氏肌营养不良症是由于肌营养不良蛋白（Dystrophin）突变所导致的全身肌肉渐进性损伤和运动功能减退的致死性遗传病。致病基因DMD长达2.3Mbp，含有79个外显子，成熟mRNA也有14kb长，整体尺寸非常巨大。然而科学家们发现，当患者在缺失了17~49号外显子的情况下，整体肌营养不良的状况反而远好于普通的DMD患者。因此，Nelson等人（Nelson et al., 2016;）利用CRISPR可以进行大片段编辑的能力删除掉了DMD模型小鼠Dystrophin基因的第23个外显子，从而减轻了小鼠肌营养不良的症状。具体来说，他们将CMV-SaCas9-polyA包装到一个AAV8颗粒中，而另一个AAV颗粒则包含了2个分别以intron 22 和intron 23为靶点的sgRNA（Fig 2.）。在两个CRISPR复合体的作用下，携带有突变的第23号外显子将被切割下来，而切割后所形成的两个DSB末端，则会通过NHEJ的修复方式被粘合到一起，这样既完整的切除了该外显子，又没有影响剩余Dystrophin基因的读码框。另一个目前正利用CRISPR大片编辑能力段进行基因治疗的病症是Leber先天性黑蒙症10型（Leber congenital amaurosis type 10-LCA10）。这个疾病是由于位于CEP290基因intron 26位置上的点突变IVS26导致了RNA错误剪切，从而影响该蛋白的表达，并最终产生病症。Maeder 等人（Maeder et al., 2019）也是利用2个sgRNA引导Cas9蛋白（AAV5:U6-sgRNA323-U6-sgRNA64-hGRK1-SV40 SD/SA-Kozak-ATG-NLS-SaCas9-NLS-pA）切割下一段携带有IVS26突变的intron 26的DNA片段，从而恢复26、27号外显子之间的正常剪接、治疗病症（Fig 3.）。基于这些实验结果，一项LCA10的基因治疗药物即将进入临床招募阶段 (ClinicalTrials.gov; identifier: NCT03872479)，并有望成为基于CRISPR基因编辑技术的第一项体内临床应用。Fig 2. CRISPR/Cas9-mediated genomic and transcript deletion of exon 23 through and intramuscular AAV-CRISPR administration. Fig 3. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10.
随着研究的深入，目前已经有多个具有RNA靶向能力CRISPR蛋白被应用到了人源细胞当中（LshC2c2，Cas13等）。与利用CRISPR系统对目标基因DNA直接进行敲除的方法相比，利用CRISPR系统来降低目标基因RNA的转录水平其实是一套更安全并且可逆的治疗方案。并且像Cas13这样以RNA为靶标的Cas蛋白，在打靶方案设计方面上它比Cas9更灵活，而在对目标RNA降解的特异性上它又比普通的RNAi方法更专一。Zhao等人发现（Fig 4.），向肿瘤动物模型注射以KRAS mRNA为靶点的CRISPR-Cas13a系统，可以降低目标基因KRAS 94%的转录量，并减缓肿瘤的生长速度（Zhao et al., 2019）。然而以RNA为靶点的CRISPR技术也有一些自身上的缺陷，其中最主要的一点就是它需要Cas蛋白必须不断与新转录出的靶点RNA结合、并完成对其的降解，从而才能维持治疗效果，而不是像常规CRISPR系统那样，通过一次性的基因编辑就可以完成持续性的治疗。因此可能需要通过使用AAV这样的病毒载体来传递CRISPR系统，从而达到CRISPR-Cas13长期在体内工作的目的。但是由此一来，当病患体内产生了针对AAV衣壳蛋白、Cas蛋白的抗体或反应性T细胞的情况后，治疗效果又会大打折扣。因此，对Cas13蛋白的免疫原性和靶向特异性的研究在改善临床应用效果上会有重要的意义。Fig 4. The design features of the ideal Cas13 system that differentiates wild type (WT) and mutated KRAS genes in normal cells or cancer cells.另注：除了使用具有RNA切割活性的Cas13来特异性降解目标RNA以外，科学家也通过使用失去切割活性的dCas13来调节目标基因的选择性剪切。例如Konermann等人（Konermann et al., 2018）使用AAV包装CRISPR-dCasRx感染神经细胞（U6-gRNA123-EFS-dCasRx-bGH pA），dCasRx蛋白在crRNA的指导下绑定在目标剪接受体、剪接供体上，从而干扰由其介导的外显子inclusion 或exclusion过程。以上所描述的基因编辑，都是利用Cas蛋白在gRNA的指导下，特异性的切割目的基因，生成DSB，然后再利用细胞自身的DNA修复途径，引入突变或者修复原基因上的突变位点。虽然这些手段效果显著，但是其完全依赖于生成DSB然后进行修复的编辑方式，所以科学家对其的安全性和有效性有一定的担忧。譬如说由CRISPR系统切割产生的DSBs有可能在细胞内导致染色体易位、删除基因组缺失、适应性降低、细胞周期功能障碍，以及激活肿瘤抑制蛋白TP53等不利反应。另外插入外源基因所依赖的HDR修复途径的有效性又非常受限于细胞类型，所以它只能在dividing cells中对DSB进行修复，并且还需要与更高效的NHEJ途径来竞争。这些都限制了基于CRISPR核酸酶活性的基因编辑技术的应用。因此，目前出现的基于CRISPR-效应物融合平台的基因编辑、修饰方法，则因为不需要形成DSB，从而避免了以上所描述的种种限制，进而也被大家逐渐重视。Fig 5. Cas-Effector Fusion Platforms for Therapeutic Purposes（1）CRISPR抑制与CRISPR激活（CRISPR interference and activation-CRISPRi/a）。当Cas9蛋白的核酸酶结构域被突变掉之后，失活的dCas9蛋白仍然可以与sgRNA形成复合物，从而特异性绑定到预设的DNA靶点之上。在哺乳动物细胞中，Gilbert等人将dCas9与Kruppel-associated box (KRAB) 转录沉默子结构域相融合，从而达到了对目的基因进行转录干扰的效果（Fig 5.）。Thakore等人利用AAV向小鼠肝部递送了可干扰Pcsk9基因转录的CRISPR系统，从而沉默了该基因在肝部的表达并降低了小鼠的胆固醇水平。另外，如果将dCas9蛋白与VP64激活结构域相融合，则可以达到在设计好的靶点周围招募转录激活因子，激活目标基因表达的效果。这一工具尤其可以用于治疗由基因单个拷贝发生突变所引起的疾病，因为在其基因组中仍有一个完好的基因表达框，如果科研人员可以使完好的这一个基因拷贝过量表达，直至可以弥补由于另一个基因拷贝因突变而失去的表达量，就可以治愈这一类的疾病。例如Matharu（Matharu et al., 2018）等人向haploinsufficient mouse模型递送了含有dCas9-VP64的CRISPR系统的AAV（AAV：CMV-SpdCas9-VP64；AAV：CMV-SadCas9-VP64），其靶点正是Sim1基因的启动子、增强子序列（Fig 6.）。在注射AAV后，这个蛋白的表达量被提高到大于野生型的表达水平，并且纠正了原有病症的肥胖表型。但就目前来说，该技术还是面临很多的风险，尤其是所激活的基因过度表达，会在机体内引起一定的毒性。Fig 6. CRISPRa Sim1 overexpression in vitro and in vivo by using AAV.CRISPR单碱基编辑系统可以特异性向目标DNA或RNA位置引入一个点突变，并且在这个过程中，不会生成DSB。大体来说，CRISPR单碱基编辑系统的原理是将nCas9或者dCas9与核碱基脱氨酶融合表达，然后sgRNA指导sgRNA-nCas9/dCas9-核碱基脱氨酶复合物绑定在所选取的靶标序列上，融合表达的核碱基脱氨酶再负责催化脱氨基反应，向靶标序列引入点突变（Fig 5.）。现在已经有多种不同的剪辑编辑器被应用到哺乳动物细胞当中，其中包括可以将胞嘧啶转换成胸腺嘧啶的胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editors ，CBEs），可以将腺嘌呤转换成鸟嘌呤的腺嘌呤碱基编辑器（adenosine base editors，ABEs）以及可以将胞嘧啶颠换成鸟嘌呤的鸟嘌呤碱基编辑器。目前CRISPR碱基编辑器已经直接被用在体内，去纠正由基因突变所导致的一些疾病，其中第一个成功的例子就是利用ABEs去治疗DMD（Ryu et al., 2018）。Ryu向小鼠注射ABEs（AAV1：U6-sgRNA-Spec5-12-NLS-ecTadA-nCas9NT-SD; AAV2:SA-nCas9CT-NLS-HA-pA）,将其Dmd基因第20号外显子上的一个A突变为G，从而将致病的无义突变-终止密码子TAG修正为谷氨酰胺密码子CAG（Fig 7.）。经过测序检测，在注射8周后，CRISPR碱基编辑器对该位点的修正频率可以达到3.3 ± 0.9%，并在17 ± 1%的肌纤维中恢复了dystrophin蛋白的表达，远超过了改善肌功能所需的4%的表达量。除此之外CRISPR单碱基编辑系统也可以以RNA为靶点，这一类的工具是将dCas13蛋白与ADAR2 (ADARdd)的脱氨酶活性中心或者胞嘧啶脱氨酶融合表达，从而达到在RNA水平修正突变碱基的目的。Fig 7. Adenine base editing in mouse embryos and an adult mouse model of Duchenne muscular dystrophy.就目前来说CRISPR单碱基编辑器，仍然以转换突变为主（transition mutations，可以将一种嘌呤突变成另一种嘌呤，或者将一种嘧啶突变成另一种嘧啶），颠换突变（transversion mutations，将一种嘌呤突变成一种嘧啶，反之亦然）则较难达成。然而最近被发明的一种名为Prime editing的编辑方式，则有望突破这一限制（Fig 5.）。Prime editor (PE)复合蛋白融合表达了nCas9蛋白与M-MLV的逆转录酶。PE在prime editing guide RNA (pegRNA)的指导下，与目标序列结合，然后由nCas9在不与pegRNA中sgRNA结构域相结合的DNA链（PAM链）上切出缺口，pegRNA中primer binding site结构域与PAM链切口上游序列3’相结合，进而以切口上游的PAM链为引物，以pegRNA中的RT templet with edit为模板，在与nCas9蛋白融合的M-MLV逆转录酶的作用下，反转录出引入了突变的DNA链，然后再由细胞自身完成最后的修复（mismatchrepair，Fig 8.）。与常规的CRISPR单碱基编辑相比，Prime editor的灵活性更高，既可以完成转换突变又可以完成颠换突变，并且有着更广的编辑范围（距离PAM 1nt-30nt）。虽然目前Prime editing的应用才刚刚开展，但是其优秀的机制优势，将会使Prime editing在修正点突变的基因治疗方面有着广阔的前景。Fig 8. Prime Editing System. 一些表观遗传学标志物，例如DNA甲基化或组蛋白修饰，也对基因表达具有重要的影响，尤其是在脑组织中，表观遗传学标志物的调节异常甚至可以引起神经系统疾病。由于这些表观遗传标志物可以通过一些酶来进行写入或者擦除，因此很多科学家将这些酶与dCas9融合表达，从而可以有目的地对一些基因位点进行表观遗传学修饰，并通过这一方法来治疗一些由表观遗传学标志物调节失常所导致的疾病。例如脆性X综合征（fragile X syndrome，FXS），这种疾病是由于FMR1 gene 5’非编码区中的CCG三核苷酸重复序列从6-50个扩增到200-2000个，从而引起了该段序列所在的FMR1启动子DNA序列过度甲基化，进而沉默了FMR1基因的表达，最终导致了病患的智力损伤等症状。Liu等人（Liu et al., 2018）将dCas9与DNA去甲基化酶TET1的活性中心融合表达，从而利用该工具特异性地对FMR1 5’非编码区中的CGG重复序列进行去甲基化，进而恢复了FMR1基因的表达（Fig 9.）。Fig 9. Rescue of Fragile X Syndrome Neurons by DNA Methylation Editing of the FMR1 Gene.在最近几年中，基于CRISPR的DNA/RNA精确编辑技术经历了快速迭代并依旧在迅猛发展，由于这些技术具有纠正致病性突变的能力，因此在基因治疗领域具有巨大的潜力。不过需要注意的是，CRISPR系统的最终应用仍有一些列的问题亟待解决。（1）向机体的递送方式。首先，如何向机体去递送CRISPR系统就是一个重要的问题，譬如说目前很被看好的基因治疗载体AAV的包装容量仅有4.7kb，但是仅SpCas9基因自身的长度就达到了4.2kb，因此很难在一个AAV颗粒中包装下Cas蛋白表达框、sgRNA以及用于指导HDR修复的donor DNA。甚至于一些融合了其他效应物的CRISPR系统，其大小更是远远超过了AAV的最大包装容量。为了解决这一问题，目前科学家正在寻找更小的Cas蛋白例如SaCas9（3.2kb）来进行基因编辑；或者通过多元AAV载体的传递方式，将CRISPR系统分割包装在两个AAV颗粒中，然后在目标细胞中重建CRISPR系统的表达。此外，也有科学家检测到有的AAV基因组DNA能够整合到目标细胞内的DSB上，这一机制目前并不清楚，但由于这与CRISPR的作用方式息息相关，因此同样引起了大家对递送方式安全性上的关注。（2）精确控制体内的基因编辑事件。目前大家对在体内长期表达一个具有活性的CRISPR编辑系统仍有一系列基于安全性上的担忧，因为这种持续表达会增加CRISPR系统最终脱靶实事件的总量。因此从安全性的角度来说，对CRISPR系统进行瞬时表达是一个更安全的治疗策略。这个策略可以利用一些非病毒的递送手段来达到，譬如将CRISPR系统的mRNA用PEG包裹后传递到细胞内，由于mRNA的不稳定性，CRISPR系统在体内工作一段时间后，所递送的mRNA会最终被降解，从而终止CRISPR在体内的表达。另外也可以将CRISPR系统设计成以诱导表达的方式在体内工作，例如使用drug-inducible promoter、light-inducible promoter来驱动其表达。除了对CRISPR系统的表达在时间上可以进行控制以外，在体内不同组织暨空间上控制也受到了大家的关注。首先用于递送的AAV具有不同亚型，这些不同的亚型对不同器官组织有一定的偏爱性，从而可以通过选用不同亚型的AAV作为递送手段，达到组织特异性传递的效果。但遗憾的是这种方法并不能严格控制CRISPR在特定组织内的专一性表达，因此，大家也在不断地寻找更多的组织特异性启动子与调控原件，从而对CRISPR的表达在空间上进行更好的控制。4. 结语
就目前来说，在将CRISPR应用于基因治疗的临床应用之前，科学家还有许多的研究要做，尤其是在治疗的安全性和递送方法方面。最后小编想用基因治疗初代大佬French Anderson对CRISPR基因治疗的判断来结束今天的回顾：“The situation with CRISPR-Cas9 is analogous to many new disruptive technologies. Initially there is enormous excitement because of the new possibilities. Then harmful side effects are discovered and the excitement is sharply curtailed. After long hard work, the full value of the technology becomes realized. This is exactly what happened in gene therapy. CRISPR-Cas9 is a very powerful technology that will be used extensively far into the future. ” 将CRISPR技术应用到基因治疗领域道阻且长，然而行则将至，行而不辍，未来可期。
Reference
Ran F A, Cong L, Yan W X, et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9[J]. Nature, 2015, 520(7546): 186-191.
Xu L, Wang J, Liu Y, et al. CRISPR-edited stem cells in a patient with HIV and acute lymphocytic leukemia[J]. New England Journal of Medicine, 2019, 381(13): 1240-1247.
Yin H, Xue W, Chen S, et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype[J]. Nature biotechnology, 2014, 32(6): 551-553.
Nelson C E, Hakim C H, Ousterout D G, et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy[J]. Science, 2016, 351(6271): 403-407.
Maeder M L, Stefanidakis M, Wilson C J, et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10[J]. Nature medicine, 2019, 25(2): 229-233.
Zhao X, Liu L, Lang J, et al. A CRISPR-Cas13a system for efficient and specific therapeutic targeting of mutant KRAS for pancreatic cancer treatment[J]. Cancer letters, 2018, 431: 171-181.
Konermann S, Lotfy P, Brideau N J, et al. Transcriptome engineering with RNA-targeting type VI-D CRISPR effectors[J]. Cell, 2018, 173(3): 665-676. e14.
Matharu N, Rattanasopha S, Tamura S, et al. CRISPR-mediated activation of a promoter or enhancer rescues obesity caused by haploinsufficiency[J]. Science, 2019, 363(6424).
Ryu S M, Koo T, Kim K, et al. Adenine base editing in mouse embryos and an adult mouse model of Duchenne muscular dystrophy[J]. Nature biotechnology, 2018, 36(6): 536-539.
Liu X S, Wu H, Krzisch M, et al. Rescue of fragile X syndrome neurons by DNA methylation editing of the FMR1 gene[J]. Cell, 2018, 172(5): 979-992. e6.
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