基因编辑技术在血友病治疗中的应用
之前在文章“AAV载体介导血友病基因治疗的研究进展与挑战”中介绍了AAV载体介导血友病基因治疗在临床研究中取得了一定的进展。AAV基因治疗血友病的原理是将factor VIII（FVIII）或者factor IX （FIX）基因递送至体内，表达有活性的凝血因子从而达到治疗的目的。然而，由于包含外源基因的AAV基因组在细胞内通常以附加体形式存在，随着肝细胞的更新AAV基因组会逐渐丢失，尽管在成人体内速度比较慢，但是治疗基因的表达始终是有限期的。而基因编辑技术是在基因组水平纠正变异基因或者靶向整合正确基因，有望实现此类单基因遗传病的永久治愈。
基因组敲入涉及有、无核酸酶两种方案。核酸酶能够在基因组靶位点产生双链切口（DSB），所以整合效率更高，而它的缺点在于脱靶引起的变异风险。目前使用的核酸酶有，锌指核酸酶（ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN），成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）/Cas蛋白系统。核酸酶诱导的DSB通过两种主要的细胞修复系统进行修复：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR/HR）。NHEJ途径是将双链DNA的两个末端直接连接，在这个过程中，DSB位点会产生小的插入和删除（indel），DSB修复中∼80%是以这种模式完成的；HR是以外源DNA或姐妹染色体作为模板进行修复，所以它是一种高保真的修复系统。因此，HR更多地被用于纠正治疗单基因突变遗传病，例如血友病。下面我们就来介绍一下采用基因编辑技术治疗血友病的现状。
图1. 基因编辑策略
1. 体内基因编辑
治疗血友病的最理想方法就是在基因组水平纠正或者替换突变的凝血因子基因。Li等构建了两种肝脏高趋向性的AAV，一种编码ZFN，另一种携带同源臂和正确的FIX cDNA，将两种AAV同时递送到人源化新生血友病小鼠体内，证明了HDR介导的体内矫正是可行的。他们的研究非常有意义，因为这是第一次成功利用核酸酶介导体内基因编辑的尝试，结果表明AAV体内递送核酸酶（ZFN）可以高效介导DSB的产生（34-47%）。尽管腹腔注射AAV到 2 日龄小鼠体内，肝组织靶向HDR效率仅为 1-3%，但足以在B型血友病小鼠模型中恢复止血。随后的部分肝切除实验表明，治疗性FIX可稳定表达长达30周，表明基因组修饰可以克服常规基因治疗的局限性，适用于肝组织快速生长的婴幼儿。之后，Anguela等证明了上述方法应用在成年小鼠体内同样有效。AAV-ZFN和AAV 供体DNA静脉注射到8周龄的人源化小鼠体内，循环 FIX恢复到正常水平的23%，且持续时间达60周以上。同一研究小组，将FVIII和FIX基因靶向整合到小鼠肝脏内源性白蛋白（Alb）基因座中，能够在血友病A和血友病B小鼠体内持续表达治疗水平的活性凝血因子。文中提到一点值得关注，即基因组上的安全港（safe harbor）。典型的基因组编辑方法是针对疾病基因座本身，然而，成功纠正的等位基因的比例可能无法表达足够水平的蛋白质来缓解疾病表型。将治疗基因整合到具有高转录活性（安全港）的基因座中或许可以解决这个问题，并提供一个通用平台来表达各种蛋白质，只需要提供相应的治疗性转基因供体。这篇文献中用到的Alb基因座就是一个很好的选择，因为它具有非常高的表达水平，而且肝脏相对于其他组织进行基因传递和体内编辑的可操作性更强。此外，白蛋白的基因结构非常适合转基因靶向内含子序列。还需要关注的是，既然AAV介导的体内基因编辑中存在NHEJ模式，那就不得不考虑AAV ITR整合的问题。还有，非整合型AAV基因组注射到体内能够稳定存在数月甚至更久，持续表达的核酸酶可能引起off-target和毒性效应。目前，Sangamo Biosciences 研究小组正在进行ZFN 介导的体内基因编辑治疗B型血友病的I期临床试验（https:// clinicaltrials.gov/ ct2/ show/ NCT02695160），希望能获得显著的治疗效果。
图2. AAV递送ZFN和供体DNA模板进行体内基因编辑
2015年，Mark Kay团队采用无核酸酶、无启动子系统，将hFIX基因整合到小鼠Abl基因终止密码子上游，肝脏细胞白蛋白等位基因中约有0.5%发生整合，血浆中FIX的表达水平为正常水平的7-20%，经治疗的因子IX缺陷小鼠的凝血时间恢复正常。使用无核酸酶整合可能具有更高的安全性，因为排除了核酸酶可能引起的脱靶突变的发生。如果可以进一步提高HDR效率，该方法可能适用于人体。
图3. 无核酸酶、无启动子基因敲入
近几年，随着CRISPR技术的发展，相继有研究团队将其运用到血友病基因校正中。Duan等为了纠正Y371D突变，分别用水动力注射裸DNA或腺病毒载体两种方式递送Cas9和供体DNA，结果显示，递送裸DNA方式FIX等位基因校正效率为0.56%，但是足以恢复止血功能。而腺病毒载体递送方式虽然整合率更高，但由于严重的肝毒性导致无治疗效果。程涛教授和张孝兵教授为通讯作者发表的论文中使用双重切割供体、NHEJ介导的异位F8基因敲入，在小鼠肝脏内的编辑效率提高了10-20倍，完全重建了FVIII活性。Intellia Therapeutics公司用脂质纳米粒子递送CRISPR/Cas9和AAV递送同源重组模板DNA在小鼠和非人灵长类体内进行基因编辑，结果显示非人灵长类体内FIX表达达到了正常水平；单次注射小鼠体内的FIX持续表达超过10个月。脂质纳米颗粒（LNP）的成分与细胞膜非常相似。它们具有优异的生物相容性、生物降解性、低毒性和免疫原性、结构灵活性和易于大规模制备等优点，适合用于核酸酶递送。
图4. LNP递送CRISPR/Cas9和AAV递送同源重组模板DNA介导的FIX基因编辑
将传统的基因治疗工具引入基因编辑领域，使体内染色体水平的编辑成为可能。然而，目前不可能将那些发生了不需要变异的细胞挑选出来，或者对编辑过的细胞进行基因分型。因此，核酸酶系统的安全性和准确性是重要的挑战。
2. 体外基因编辑
体外（离体）基因校正是血友病治疗的另一策略。因为移植纠正过的自体细胞可以避免免疫排斥，并且能在移植前进行基因型和表型分析。比如，患者特异的诱导多能干细胞（iPSCs），它们具有无限的自我更新能力，可以来源于单细胞克隆，而且可以分化为人体不同类型的细胞。需要注意的是，在患者特异性iPSC疗法的操作过程中，必须避免培养物中可能残留的多能干细胞，或者分化成不需要的细胞类型，并且必须检测和消除在多次细胞分裂过程中可能发生的随机和罕见的基因突变，以防止肿瘤形成。
Park等用CRISPR/Cas9系统介导的NHEJ模式将血友病A患者尿液样本来源的iPSCs染色体内含子大片段倒位（structural variations, SV）纠正成野生型，通过深度全基因组测序分析显示没有脱靶突变。尽管通过移植基因组纠正的iPSC分化的内皮细胞可以在一定程度上治疗小鼠的FVIII缺乏症，但需要进一步研究以解决以下问题，比如：基因校正效率低，如何有效分化为肝窦内皮细胞（LSEC，主要的FVIII合成细胞），优化移植部位，提高移植细胞的存活率等。
图5. 使用CRISPR-Cas9对A型血友病患者来源的iPSC中的FVIII基因染色体倒位进行校正
与在体编辑相似，在safe harbor基因座中敲入凝血因子基因是离体基因校正的另一个重要选择。Pang 等人在重度血友病的iPSC模型上，使用TALEN靶向 rDNA 基因座敲入了CMV 启动子调控的 BDD FVIII cDNA。Sivalingam等人使用融合增强FokI-Sharkey结构域的ZFN在人脐带衬里上皮细胞的AAVS1位点中敲入了正确的FVIII基因，整合细胞能稳定地分泌活性FVIII。此类途径的优势在于可以通过全基因组分析分离出没有脱靶突变的克隆，但移植到动物体内的治疗效果还需要进一步验证。
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