AAV载体介导血友病基因治疗的研究进展与挑战
腺相关病毒（AAV）介导的血友病基因治疗经临床试验证明了其有效性。然而， FDA 拒绝了 BioMarin Pharmaceutical 提交的首个血友病基因治疗产品的生物制剂许可申请，虽然结果令许多人感到惊讶，但说明了对于实现血友病AAV基因治疗潜力至关重要的突出问题仍然存在。本文将带大家了解一下AAV载体在血友病基因治疗中的研究进展与挑战。
1.血友病的常规治疗方法
血友病 A 和 B 是分别由因子 (F) VIII 和 IX 蛋白缺失或功能障碍引起的 X 连锁隐性疾病。出血是血友病的主要症状，尤其是关节或肌肉出血。流行病学调查显示，每 100,000 名男性患血友病 A 和 B约为 17.1和 3.8。
血友病主要使用凝血因子 VIII (FVIII) 或 IX (FIX) 浓缩物作为替代疗法进行治疗。因子替代疗法旨在减少复发性出血引起的使人衰弱的肌肉骨骼并发症，延长预期寿命，并促进就业和独立生活；然而，并没有消除患关节病的风险。此外，因子替代疗法存在较大的局限性，包括定期输注的负担、成本负担、抑制性抗体以及在许多国家的可用性有限等。
Emicizumab (Hemlibra®)，这是一种针对 FIXa 和 FX 的人源化单克隆双特异性抗体，通过桥接激活因子(F) IX和FX来恢复A型血友病的FVIII激活功能缺陷。使用 Emicizumab 进行有效预防需要坚持定期注射，而出血保护可能不完整，患者仍有因重大创伤和手术而出血的风险。
2.血友病基因治疗的基本原理
如血友病的一类单基因遗传病，是由于单个基因变异导致功能性蛋白质不表达或表达为非功能性蛋白质而引起的疾病，基因治疗则提供致病基因的功能性拷贝，从而有效地治疗该疾病。基因治疗最初的障碍是治疗基因低效递送至靶细胞，通过采用源自哺乳动物病毒的病毒载体可将其遗传物质递送到细胞和组织中这一自然特性，成功解决了治疗基因递送问题。这些载体通常包含最少的野生型病毒序列，并且它们的致病基因、复制基因和结构病毒基因被治疗基因盒替换。多年来，在血友病基因治疗中，使用腺相关病毒 (AAV) 载体进行的肝脏体内基因转移在临床前和临床研究中取得了极大的成功。
血友病非常适合通过基因治疗进行纠正，因为出血表型对广泛的因子水平有反应，不需要精确的调节。此外，由于凝血因子蛋白被分泌到循环中，将基因传递到部分肝细胞即可纠正出血因素。FVIII 和 FIX 可以在非天然细胞和组织中合成。例如，尽管 FVIII 是由肝血窦内皮细胞（LSEC）和肝外内皮细胞等特殊内皮细胞自然分泌的，但在肝细胞中的表达产生的功能性蛋白质已证实能在动物模型和人类患者中恢复止血。最后，对于因因子供应不足而导致合并症和死亡的发展中国家患者，基因治疗可以通过单次治疗而持续提供凝血因子。
3.AAV载体
AAV 载体源自野生型 AAV，是细小病毒家族的成员。野生型 AAV 无致病性、免疫原性弱、复制缺陷，需要辅助病毒进行复制。AAV 载体可以将长达 5 kb 的治疗性转基因盒传递到分裂和非分裂细胞中。AAV 血清型根据病毒衣壳同源性分为进化枝，病毒衣壳控制组织嗜性和细胞内病毒颗粒运输。通过随机和定向诱变以及衣壳基因改组产生的工程化 AAV 衣壳被不断开发以增强人类肝细胞的趋向性，抵抗中和抗体，并避免细胞毒性 T 细胞对转导肝细胞的载体消除。表达盒的工程化也是基因治疗成功的关键。例如，可以通过设计更强的肝脏特异性启动子、F8 和 F9 cDNA的密码子优化，以及使用工程化 F8（B 域缺失的 FVIII 变体）和 F9（过度活跃的 FIX-Padua 变体 R338L）来增强载体效力。一些临床试验使用消除了免疫刺激性 CpG 基序的表达盒。然而，由于病毒基因组的反向末端重复序列也包含 CpG 基序，因此不可能从载体中完全消除它们。此外，研究表明血友病动物模型中的 AAV 载体肝脏导向基因治疗通过诱导因子特异性的调节性 T 细胞 (Treg) 诱导对 FVIII 和 FIX 的免疫耐受。例如，AAV-F8 和 AAV-F9 载体肝基因转移是犬血友病模型中的有效诱导免疫耐受。尽管这些结果令人鼓舞，但对人体是否引起相同效应仍需得到证实。
4.AAV基因治疗临床试验
4.1血友病A临床试验
BioMarin 启动了血友病 A 的首个临床试验，BMN 270，使用AAV5 载体介导表达密码子优化的 BDD-FVIII-SQ 蛋白的肝脏基因转移。以低载体剂量治疗的初始患者几乎检测不到 FVIII 水平。以大约 3 倍高剂量治疗的第二名患者具有稳定的 FVIII 水平，在 1% 至 3% 之间，并且停止使用预防性 FVIII 蛋白。最高剂量组（6 × 1013 载体基因组 [vg]/kg）的患者表达了一系列治疗性 FVIII 水平，中位数为 77%， 52 周时为正常值的 19% 至 164%，且重组 FVIII 的使用剂量和年出血率显著降低。在高剂量组中接受治疗的大多数患者接受了延长疗程的预防性泼尼松龙治疗，以应对参与者 3 中观察到的转氨酶轻度升高。一个有 6 名参与者的递减剂量组接受了 2/ 3 最高剂量。在载体治疗后 24 周和 FVIII 蛋白治疗停止时，平均表达为正常值的 33%，且没有出血报告。
BMN 270 是使用杆状病毒-昆虫细胞生产系统生产的。这是第一次使用快速载体剂量递增（在第一个接受治疗的患者未能显示疗效后增加载体剂量）和预防性泼尼松龙给药的血友病试验。预计总共有 130 名患者参与的两项 3 期研究已经启动，目标载体剂量为 4 × 1013 vg/kg 和 6 × 1013 vg/kg。此外，BioMarin 正在应邀参加一项 1/2 期研究，以评估在具有预先存在的 AAV5衣壳抗体的血友病 A 患者中的高剂量基因递送。
Spark Therapeutics 公司公布了Spk8011载体治疗血友病 A 患者的初步试验数据，包括2 名接受初始低载体剂量治疗的患者，3 名接受中等剂量治疗的患者，以及 7 名接受高剂量的患者。报告的载体剂量范围从 5 × 1011 到 2 × 1012 vg/kg（分别为2倍递增）。2 名低剂量治疗患者表达水平为正常 FVIII 蛋白的10% 和 13%，3 名中等剂量治疗的患者中有 2 名表达水平为正常 FVIII 蛋白的8% 和 12%。根据 Spark Therapeutics 发布的数据，在最高载体剂量下观察到更高水平的表达（到 3 个月平均为正常 FVIII 活性的 30% 和 49%），但也观察到了毒性。该试验首次使用了从衣壳库中筛选的具有人类肝细胞趋向性和抗抗体中和的新型衣壳。值得注意的是，尽管直观看此试验与上述AAV5 试验相比，使用了较低的载体剂量，但由于不是基于相同的实验方案，因此并不能进行平行比较。
4.2血友病B临床试验
在许多正在进行的血友病 B的AAV 临床治疗试验中，其中几个显示出显著的成功。伦敦大学学院 (UCL) 和圣裘德儿童研究医院进行的临床试验中使用了scAAV2/8-LP1-hFIXco 载体，是血友病B基因治疗的第一个长期成功案例。第一位患者于 2009 年接受治疗，是该试验对肝脏中 AAV 载体 FIX 蛋白表达的安全性和稳定性的最长随访。然而，一些患者的 FIX 水平早期下降，研究者分析与衣壳 T 细胞反应相关的短暂转氨酶升高有关，在用递减的泼尼松龙治疗后趋于稳定。最后报告的 6 名患者的高剂量组(2 × 1012 vg/kg) 中的 FIX 水平平均为 6.1%，范围为 2.89% 至 7.2%。
Spark Therapeutics开展的血友病 B 临床试验，使用具有多个氨基酸突变的 AAV8 衣壳来包装FIX-Padua 表达盒。FIX-Padua 是一种天然存在的过度活跃的 FIX 变体 (R338L)，其活性约为天然FIX 的8 倍。10 名患者以 5 × 1011 vg/kg 的剂量接受治疗，平均 FIX 活性为 33.7%，范围为 14% 至 81%。其中两名受试者，分别为7 岁和 9 岁，患有无症状的一过性转氨酶升高，通过类固醇治疗得到解决，只有 1 名受试者显示 FIX 活性中度下降。另外 8 名在随访期间具有稳定的 FIX 活性，并且没有 AAV 衣壳 T 细胞反应的迹象。目前，正在招募新患者进行III期试验。
UniQure公布了他们使用 AAV5 载体进行血友病 B 临床试验的数据，该试验使用与伦敦大学学院和圣裘德儿童研究医院试验相同的 F9 表达盒。招募了 10 名患者，其中 5 名接受了低剂量治疗，另外 5 人接受了 4 倍高剂量治疗。低剂量组中的平均 FIX 水平为 4.4%，范围为 1.3% 至 6.8%。高剂量组的平均 FIX 为 6.9%，范围为 3.1% 至 12.7%。然而，UCL 和 Spark 的血友病 B 试验似乎都使用较低的载体剂量来实现相似或更高的疗效。与 BioMarin 试验类似，几名患者表现出短暂的转氨酶升高，但没有衣壳 T 细胞反应的迹象。鉴于所使用的高载体剂量，检查这些载体制剂中肝毒性的其他潜在原因可能是有意义的。使用高剂量 FIX-Padua 变体的新剂量确认试验（2 × 1013 vg/kg）列入计划并预计招募 3 名 B 型血友病患者，并将根据结果进行III期研究。
表1. 在clinicaltrials.gov上注册的正在进行的血友病基因治疗临床试验
5.AAV 介导HA基因治疗临床实施的挑战
5.1AAV 载体的放大生产
对于广泛的治疗用途，需要合适的放大生产方法来生产足够数量的临床级 AAV 载体。在目前的血友病临床试验中，哺乳动物细胞（如 HEK293 细胞）转染系统或昆虫细胞-杆状病毒系统均已被用于生产AAV 载体。杆状病毒系统的改进工作还在进行，基于痘苗病毒的哺乳动物细胞中放大的平台也在开发，此外还有AAV 的永久生产细胞系也在开发中。然而，这些生产系统在免疫反应和毒性中的潜在作用仍有待确定。
5.2AAV介导的基因治疗的安全性
鉴于所有 AAV 血清型都转导肝细胞，长期安全考虑主要集中在肝毒性风险上，主要毒性是载体输注后肝转氨酶的剂量相关性升高。在一些（虽然不是所有）的研究中，这与细胞介导的 AAV 衣壳免疫的证明相吻合。大多数研究使用皮质类固醇进行早期干预或预防，目的是保护转导的肝细胞。尽管使用这种方法可以有效控制大多数发作，但仍有一些发作与转基因表达的部分或完全丧失有关。此外，一些患者出现转氨酶升高而无衣壳T 细胞反应或有衣壳T 细胞反应但转氨酶水平不升高。说明这种毒性与可检测到的抗 AAV 衣壳 T 细胞反应并不一定完全吻合，它的潜在机制可能很复杂，比如与未折叠蛋白反应等因素。
此外，据报道，在 AAV基因转移后，粘多糖症 VII 型小鼠模型中肝细胞癌 (HCC) 的发病率增加，这可能是通过整合和破坏小鼠染色体上富含 miRNA 和 snoRNA 的印记区域所致。其他鼠类模型未能重现这一发现。总的来说，各种动物模型中的可用数据表明尽管 AAV 整合似乎存在于一些人类 HCC，但AAV 的肿瘤发生风险相对较低。然而，仍需要密切关注这种潜在风险，因为~90% 超过 35 岁的严重血友病患者感染了医源性丙型肝炎病毒 (HCV)，这是发生 HCC 的既定危险因素。
6.总结
基因治疗有巨大的潜力使得血友病患者体内产生正常水平的 FVIII 或 FIX。该领域自其平淡无奇的起步以来取得了长足的进步，并持续发展，但仍有很大的改进空间。AAV 载体已成为基因添加和校正的主力，未来的研究将集中在完善衣壳、转基因和启动子的设计上，以追求更好的转导效率、免疫惰性和治疗效果的可预测性。与动物模型中几乎 100% 的转导效率相比，在人类的肝细胞转导效率在实现蛋白质的高表达方面还有不足之处，同时应保证不会冒蛋白质过载引起细胞应激的风险。
虽然基因治疗目前还面临着一些挑战，但未来可期，随着技术的不断发展成熟，有理由相信未来将开发出更加安全有效、甚至个性化的治疗方案，来真正改善血友病患者的生活质量。
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