mRNA疫苗在感染性疾病的研究进展
以mRNA为基础的治疗代表了一个相对新颖和高效的药物类别。最近发表的几项研究强调了mRNA疫苗在治疗不同类型的恶性肿瘤和传染病方面的潜在疗效，这些疾病中传统的疫苗策略不能引起保护性免疫反应。
传染病疫苗是目前mRNA疗法中最领先的应用。目前正在进行临床前试验和临床使用的大多数mRNA疫苗都是以单次给药的形式注射到皮肤、肌肉或皮下，在那里它们被免疫或非免疫细胞吸收并转化为抗原，展示给T细胞和B细胞。
截至2019年底，15种针对传染病的候选mRNA疫苗已进入临床试验，当时，人们认为mRNA疫苗至少还需要5－6年才能获得监管部门的批准。但是，当2020年初COVID－19大流行横行世界时，这些期望就被颠覆了。在接下来的几个月里，mRNA疫苗的研发、制造和部署都进入了飞速跨越的阶段。
SARS－CoV－2疫苗
大多数SARS－CoV－2候选疫苗对病毒表面的棘突蛋白产生免疫反应。棘突蛋白与其宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2结合。然后，细胞的跨膜丝氨酸蛋白酶2将附着的棘突蛋白切开，该蛋白酶诱导构象变化，暴露棘突蛋白的融合肽并促进与细胞或内体膜的融合。通常，疫苗mRNA编码的抗原要么是全长棘突蛋白，要么是棘突蛋白的受体结合域。
截至2021年6月18日，185个CVID－19疫苗候选处于临床前开发阶段，另外102个已进入临床试验。在临床试验中，19种为mRNA疫苗。2020年12月11日，辉瑞的BNT162b2疫苗获得了FDA的紧急授权，成为第一个获准用于人体的mRNA药物。一周后，Moderna疫苗mRNA－1273也被授权在美国使用。最终，它们是第一批在美国、英国、加拿大和其他几个国家获得授权的SARS－CoV－2疫苗。
辉瑞和BioNTech共同开发了五种mRNA候选疫苗，它们编码棘突蛋白抗原的变体。两个主要候选药物BNT162b1和BNT162b2使用Acuitas Therapeutics的可电离脂质ALC－0315和核苷修饰的mRNA，其中所有尿苷被N1甲基假尿苷取代，以增强mRNA翻译。BNT162b1编码三聚体分泌型棘突蛋白的受体结合域，而BNT162b2编码全长SARS－CoV－2棘突糖蛋白，S2亚基中有两个脯氨酸替换，将蛋白锁定在融合前构象。
在两种疫苗的第一阶段试验中，都可诱导高滴度的中和抗体，并产生强烈的CD4＋和CD8＋反应，伴有轻度至中度不良反应。两种候选疫苗耐受性良好且有效，但只有BNT162b2疫苗因其较轻的全身和局部不良反应而进入II／III期试验。在第三阶段试验中，BNT162B2显示了95％的整体预防和90～100％的疗效。
Moderna与国立卫生研究院合作开发了mRNA－1273。该疫苗使用了可电离脂质SM－102制备LNP，该LNP封装N1甲基假尿苷修饰的mRNA。该序列编码SARS－CoV－2棘突蛋白，带有两个脯氨酸替换，赋予融合前构象。
在1期临床试验中， mRNA－1273非常有效且耐受性良好。在涉及30420名志愿者的III期试验中，两支100μg剂量疫苗的预防率为94．1％，注射部位的局部疼痛是最常见的副作用。第二次给药后，一半的志愿者报告了中度至重度系统性副作用（例如疲劳、肌肉疼痛、关节疼痛），这些副作用在48小时内消失。
尽管辉瑞和Moderna公司生产的疫苗已证明具有良好的疗效和安全性，但它们对冷链储存的需求带来了保障的巨大困难。mRNA－1273可在4－8℃下储存持续一个月，而BNT162b2则需要在－60℃条件下储存。
CureVac的候选疫苗CVnCoV在5℃下可稳定储存3个月。CVnCoV使用Acuitas Therapeutics（可能是ALC－0315）的可电离脂质和编码具有两个脯氨酸替代物的全长棘突蛋白的未修饰mRNA。在第一阶段临床试验中，志愿者产生的中和抗体与CVID－19恢复期患者相似，耐受性良好。然而不幸的是，在包括4万人的III期临床试验中，CVnCoV仅显示出47％的疗效。中期分析表明，CVnCoV的较低疗效归因于新出现的SARS－CoV－2变异。
目前，CureVac正与GSK合作，开发第二代候选药物——CV2CoV，该药物经过优化，以增强相对于CVnCoV的翻译和免疫原性。CV2CoV使用来自人类羟基类固醇17－β－脱氢酶4基因的5′UTR和来自人类蛋白酶体20S亚单位β3基因的3′UTR。在临床前研究中，CV2CoV在体外显示出比CVnCoV高1．8倍的蛋白表达，并在大鼠中诱导针对B．1．1．7、B．1．1．298和B．1．351变体的高滴度交叉中和抗体。
另一种耐热候选疫苗ARCoV由中国人民解放军军事科学院与Walvax生物技术公司合作开发，可以在25℃稳定一周。ARCoV编码棘突蛋白的受体结合域。在临床前研究中，在食蟹猴中可诱导高SARS－CoV－2特异性IgG抗体和强病毒中和滴度。尽管CVnCoV和ARCoV热稳定性背后的原因尚不清楚，但mRNA二级结构、较小的mRNA大小、GC含量和脂质可能是重要因素。
其它一些mRNA候选疫苗也正在研制中。LNP－nCoVsaRNA由伦敦帝国理工学院和Acuitas Therapeutics合作开发，编码全长棘突蛋白。目前，正在使用0．1–1?g剂量递增方案进行I期临床试验评估（ISRCTN17072692），其使用了所有候选mRNA疫苗中最低的RNA剂量。
另一种自扩增mRNA疫苗候选物ARCT－021（也称为LUNAR－COV19）由Arcturus公司利用其专有的LUNAR脂质载体和自转录和复制RNA（STARR）平台开发。它编码全长融合前棘突蛋白。
流感病毒疫苗
全世界每年约有29万至65万人死于流感病毒。目前的疫苗以促进病毒进入的病毒血凝素蛋白为靶标。传统的流感疫苗是生长在鸡蛋中的灭活流感病毒，生产时间长，纯化困难。此外，病毒会在鸡蛋中发生变异以获得最佳生长，有时会使它们在人类中无效。
因此，确实需要替代的抗原靶点和生产方法。体外转录的合成mRNAs可以满足这一需求，并确保在出现全新流感毒株时快速生产疫苗。例如，2013年，基于LNP（DLinDMA）的自我扩增mRNA疫苗在中国H7N9爆发后8天内迅速研制成功，然而不幸的是，由于当时没有用于mRNA制造的GMP设施，未能进行临床试验。
也有人致力于研制一种不需要每年修改的通用流感疫苗。这种疫苗可以对几种流感病毒株和亚型产生免疫力。在2012年首次展示的流感mRNA疫苗，三次皮内注射在小鼠中分别诱导针对H1N1和H5N1毒株的同源和异源免疫。
值得注意的是，不易发生突变的血凝素保守柄区最近已成为一种新型通用疫苗靶标。还有另一项研究使用LNPs来递送50ng剂量的mRNA，编码三种保守的流感蛋白：神经氨酸酶、核蛋白和基质－2离子通道蛋白以及血凝素柄区。令人难以置信的是，这种微小的mRNA剂量产生了广泛的保护性抗体。
寨卡病毒疫苗
寨卡病毒感染于1947年首次被发现，感染寨卡病毒的患者通常无症状或出现发热、皮疹和肌肉疼痛等轻微症状。然而，寨卡病毒在2015－2016年美洲流行期间成为全球健康危机，该病毒在怀孕期间导致严重胎儿神经畸形和胎儿死亡。膜和包膜蛋白（prM－E）是针对寨卡病毒的mRNA疫苗常见的抗原选择，因为针对prM－E的中和抗体可以防止病毒融合。
Moderna与华盛顿大学医学院合作，开发了一种改良的prM－E mRNA，其中包含E蛋白中的突变融合环形表位。两个10?g剂量的mRNA可保护小鼠免受寨卡病毒攻击，并减少登革热增强抗体的产生。这些令人鼓舞的临床前结果促进了I期试验的进行，中期结果表明，疫苗mRNA－1893在10天内诱导94－100％的血清转阳，耐受性良好。
此外，另一项研究使用被动免疫方法，利用基于角鲨烯的纳米载体递送编码ZIKV中和抗体的mRNA。对于免疫系统受损而无法合成自身抗体的免疫缺陷患者来说，这是一种很有吸引力的方法。
HIV病毒疫苗
全球范围内，艾滋病毒目前影响3800万人，预计到2030年将影响多达4200万人。尽管已进行了30年的研究，但尚未开发出有效的疫苗，这主要是因为HIV包膜蛋白具有显著的抗原性多样性以及隐藏关键包膜蛋白表位“聚糖屏障”。几项临床前研究已经使用了多种载体，包括阳离子纳米乳剂、DOTAP／DOPE脂质体、Polymers和可电离LNP，它们在不同程度看到了一些效果。这些研究表明，除了有效的载体外，新的抗原对于有效地靶向HIV是非常关键的。
呼吸道合胞病毒疫苗
呼吸道合胞病毒是全球急性下呼吸道感染的主要原因。每年，估计有60000名5岁以下儿童死亡，超过14000名65岁以上的人死亡。
目前的RSV候选疫苗主要针对高度保守的F蛋白。尽管一些候选者由于中和抗体滴度不足而未能通过临床试验，但对F蛋白构象的新发现表明，针对融合前构象接种疫苗可产生优异的中和抗体反应。这一发现有望改进未来的疫苗设计。
Moderna正在评估编码融合前F蛋白的三种单剂量候选疫苗：mRNA－1172和mRNA－1777用于成人，以及mRNA－1345用于儿童。在I期临床试验中，mRNA－1777诱导RSV中和抗体产生强烈的体液反应，CD4＋T细胞对RSV F蛋白产生反应，且无严重不良事件。mRNA－1345的序列已被进一步设计和密码子优化，以增强相对于mRNA－1777的翻译和免疫原性。接种后1个月，mRNA－1345产生的中和抗体滴度约为mRNA－1777的八倍。最终，Moderna的目标是将mRNA－1345与其儿科人类偏肺病毒／副流感病毒3型（hMPV／PIV3）候选疫苗mRNA－1653整合，并用单一配方为儿童接种针对三种不同病原体的疫苗。
埃博拉病毒疫苗
埃博拉病毒（EBOV）于1976年首次被确定为导致埃博拉病爆发的病原体。这种病毒性出血热在2014－2016年西非埃博拉疫情中夺走了11000多条生命。2019年，FDA批准了一种基于重组水泡性口炎病毒（VSV）的埃博拉疫苗（rVSV－EBOV）。尽管与未接种疫苗相比，rVSV－EBOV在预防埃博拉传播方面的有效性为97．5％，但临床试验注意到一些安全问题（例如急性关节炎和皮疹）。
抗EBOV的mRNA疫苗可能比这种基于病毒的疫苗更安全，因为它们不会在体内复制。一种编码EBOV糖蛋白的mRNA疫苗已在小鼠中证明了效力。该疫苗通过CD8＋和CD4＋T细胞诱导糖蛋白特异性IgG抗体和IFN－γ以及IL－2的强烈表达，可保护动物免受致命病毒的伤害。
狂犬病毒疫苗
狂犬病是一种人畜共患病，以神经症状为特征，死亡率近100％。尽管已有疫苗获批，但每年仍有5万多人死于狂犬病，这突出表明需要更有效、更廉价的疫苗。
为了满足这一需求，CureVac利用其RNActive平台，筛选出编码狂犬病病毒糖蛋白的未经修饰的mRNA疫苗CV7201。在一项临床前研究中，CV7201可诱导小鼠和猪的高中和抗体滴度，并诱发抗原特异性CD4＋和CD8＋T细胞反应。但是在I期临床试验中发现，虽然给药途径不影响免疫反应，但给药装置只有皮内注射器产生短暂的体液免疫反应。这种弱的给药效果以及高发生率的不良事件表明需要进一步优化给药平台。
随后，CureVac使用Acuitas Therapeutics生产的专有LNP作为其新疫苗CV7202的载体。在一项临床前研究中，CV7202诱导产生强抗体滴度和CD8＋和CD4＋T细胞反应。I期临床试验结果表明，两个1?g剂量可产生高滴度中和抗体以及强适应性免疫反应，耐受性良好。
疟原虫疫苗
尽管开发中的绝大多数mRNA疫苗是为了防止病毒感染，但也有预防其他传染病的努力。疟疾是由单细胞真核寄生虫引起的，其发病率和杀伤力位居榜首。每年，疟疾折磨着全世界2亿多人，夺走40多万患者的生命。由于缺乏表面抗原和疟原虫的复杂生命周期，抗疟疫苗的生产一直很困难。幸运的是，人体对疟原虫感染的自然免疫反应的研究已经确定了潜在的非表面抗原靶点。
例如，疟原虫分泌的细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子（PMIF）已被证明可阻止T细胞产生长期记忆。根据这一发现，从基于角鲨烯的阳离子纳米乳剂中制备了一种疫苗，该纳米乳剂装载有编码PMIF的自扩增mRNA。两个15?g剂量可改善辅助性T细胞的发育，并诱发抗疟原虫IgG抗体和记忆性T细胞反应。
另一项关于疟疾感染的机制研究发现，恶性疟原虫富含谷氨酸蛋白（PfGARP）是一种潜在的mRNA疫苗靶点。一种编码PfGARP抗原的核苷修饰mRNA疫苗正在开发中，该疫苗使用了Acuitas Therapeutics专有的LNP。临床前研究表明，该疫苗可以降低动物感染疟原虫后的反应。
文章来源：
1． mRNA vaccines for infectious diseases：principles， delivery and clinical translation． Nat RevDrug Discov． 2021 Aug 25 ：1–22．
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