mRNA疫苗：脂质纳米粒递送系统及其辅料的深度梳理

细胞与基因治疗领域 2022-06-21

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1.mRNA疫苗

早在1976年，人类就已经实现对核酸分子的包载和递送，采用的载体是聚合物粒子。2018年8月10日，FDA批准首款siRNA药物Onpattro，通过抑制特定mRNA的表达，有效阻止变异甲状腺素运载蛋白的生成，清除组织里的淀粉样蛋白沉积，发挥RNAi对基因的“沉默”效果，是一种靶向甲状腺素运载蛋白(TTR)的siRNA疗法。2020年12月11日，FDA授权辉瑞和BioNTech运用mRNA技术共同研发新冠疫苗的紧急使用许可，这是首个利用mRNA技术路线上市的疫苗。

如果从1961年发现mRNA算起，人类花费了近六十年时间才将mRNA应用于临床，这主要是因为mRNA是带负电荷的长链大分子，与同带负电荷的细胞膜因静电排斥难以入胞；并且mRNA分子是单链，本身脆弱已被酶降解，很难递送入细胞内编码蛋白。因为裸露的mRNA分子无法安全抵达胞内编码区，酶降解和膜屏障阻碍着mRNA疫苗的发展。

表2 Pfizer-BioNTech和Moderna上市疫苗成分对比

组分	Pfizer-BioNTech	Moderna
活性成分	mRNA-1273	BNT-162b2
脂质辅料	可电离脂质	ALC-3015	SM-102
中性脂质	DSPC	DSPC
胆固醇	√	√
PEG化磷脂	ALC-0159	PEG2000-DMG
其他成分	KCl	三乙醇胺
KH₂PO₄	三乙胺盐酸盐
NaCl	乙酸
K₂HPO₄·2H₂O	醋酸钠
蔗糖	蔗糖

2.mRNA疫苗的开发历程

2.1 递送载体

鱼精蛋白是最早用于递送mRNA疫苗的载体，鱼精蛋白富含精氨酸带正电荷，能络合mRNA分子。mRNA分子的粒径为50nm，与鱼精蛋白络合后粒径变为250~350nm。

阳离子纳米乳（Cationic Nanoemulsion，CNE）是以阳离子脂质DOTAP（(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵）和佐剂（角鲨烯、三油酸山梨坦、聚山梨酯80）在pH为6.50的柠檬酸缓冲液中混合而成；纳米结构脂质载体（NanostructuredLipid Carrier，NLC）是阳离子纳米乳和脂质纳米粒的混合物，由液态油相和固态脂质（饱和甘油三酯）组成。阳离子纳米乳和纳米结构脂质载体都可以用于递送mRNA分子。

阳离子聚合物也是递送核酸分子的常用载体，例如聚L-赖氨酸、DEAE-葡聚糖、聚乙烯亚胺（PEI）、二乙胺乙基葡聚糖、聚β氨基酯(PBAE)、壳聚糖等等，这类阳离子聚合物只需要与核酸分子简单混合，就能通过静电吸附形成复合物。但是这类载体在动物实验中表明，其递送效率远低于脂质纳米粒。

2.2 脂质纳米粒（LNP）

由阳离子脂质DOTAP结合可电离且能促进膜融合的DOPE（二油酰磷脂酰乙醇胺）是最早用于递送DNA的载体，后续发展用于多种类型细胞mRNA转染，虽然体外有效，但是阳离子脂质的季铵基团使载体被快速清除，还表现出一定的细胞毒性。

脂质纳米粒（Lipid Nanoparticle，LNP）是由稳定化质粒-脂质颗粒(Stabilized plasmid-lipidparticle，SPLP)发展而来。稳定质粒-脂质颗粒是由可电离并能促进细胞膜融合的DOPE和季铵化阳离子脂质DODAC组成，通过静电作用包载DNA，外层包裹亲水性的聚乙二醇（PEG），提高水溶液中稳定性的同时还能限制给药后与蛋白质和细胞相互作用。稳定质粒-脂质颗粒中的DOPE至关重要，在颗粒被细胞摄取后，DOPE在内涵体的酸环境中质子化，使膜稳定性变差，以促进内涵体逃逸。

稳定质粒-脂质颗粒的递送思路被用于递送siRNA，即为稳定化核酸-脂质颗粒(Stabilized Nucleic Acid LipidParticle，SNALP)，由可电离阳离子脂质（不含季铵基团）、两性脂质（季铵化）、DSPC（二硬脂酰磷脂酰胆碱）、胆固醇和PEG化脂质组成。该脂质颗粒通过静电作用结合核酸分子，可电离脂质发挥其环境响应的特性帮助脂质颗粒内涵体逃逸。

图1 脂质纳米粒的结构示意图

脂质纳米粒是对稳定质粒-脂质颗粒进行优化的载体。通过对可电离脂质的优化和筛选，发现MC3脂质是最适合这种递送系统的关键辅料，并且MC3：DSPC：胆固醇：PEG化脂质的最优摩尔比是50：10：38.5：1.5。其中可电离脂质含有正电荷基团，在纳米粒形成过程中与带负电荷的mRNA相互作用，并在细胞摄取过程中促进mRNA分子的递送；中性辅助脂质支撑纳米颗粒脂质双层结构的形成并稳定其结构排列；胆固醇的膜融合性促进mRNA分子的递送；PEG化脂质在纳米颗粒的表面改善其亲水性，避免被免疫系统快速清除，在存储过程中防止颗粒聚集，增加稳定性。

图2 LNP-mRNA疫苗给药途径

3.mRNA疫苗递送系统辅料

脂质是两亲性分子，由极性头部基团、疏水尾部基团和连接键（linker）组成，其中阳离子脂质、可电离脂质和其他类型脂质作为关键辅料用于递送mRNA。

图3 磷脂结构示意图

3.1 阳离子脂质

阳离子脂质具有永久携带正电荷的亲水头部基团，通常由叔胺或季铵盐构成，更容易被细胞摄取。头部极性基团通过静电作用与带有负电荷的核酸分子相结合，并且影响着递送系统的包载效率、递送效率和细胞毒性。随着阳离子脂质用量的增加，Zeta电位过高会造成明显的细胞毒性，所以处方中的阳离子脂质用量必须平衡安全性和有效性。

例如含季胺基团的DOTMA（二油酰丙基氯化三甲铵，1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷）结构上具有“较大尾扇，较小头部”的特性，在微观形态、体内稳定性和与细胞膜相互作用等方面效果更好，Invitrogen的转染试剂Lipofectin中就是合用DOTMA和DOPE（二油酰基磷脂酰乙醇胺）为载体。

DOTAP（(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵）是DOTMA的可降解类似物，可单独或与其他材料结合制备阳离子纳米乳，也可以与聚合物合用制备杂合纳米粒，用于mRNA分子递送治疗癌症、病毒感染和遗传疾病。但DOTAP的包载效率不如DOTMA，等量活性药物分子需要更高的用量才能包载，可能诱发的细胞毒性也更大，安全性较DOTMA差。

除上述阳离子脂质外，带有阳离子基团的DOSPA、ePC和DDAB也可应用于核酸分子递送。

图4 部分阳离子脂质结构式

3.2 可电离脂质

可电离脂质会在pH值较低时质子化转化为阳离子脂质，而在正常生理pH值下又转化为中性脂质。中性脂质与血细胞的阴离子细胞膜相互作用较少，提高脂质纳米粒的生物相容性。当脂质纳米粒被细胞内吞后，内涵体中的pH值较低，脂质被质子化而带正电荷，膜结构的稳定性变差甚至被破坏，利于脂质纳米粒内涵体逃逸。总的来说，就是脂质的pH敏感特性有利于包载mRNA分子的脂质纳米粒体内递送。

DLin-DMA脂质是最早合成出来用于siRNA分子递送的，通过修饰连接键和疏水基团，将DLin-DMA脂质优化为DLin-KC2-DMA，再对头部氨基进行优化合成了DLin-MC3-DMA（也可以简称MC3），极大地改善了递送效率，DLin-MC3-DMA作为关键成分被用于FDA批准的第一个批siRNA药物Onpattro。

基于MC3开发的脂质也被用于mRNA分子的递送，例如蛋白质替代疗法、抗病毒疗法等。后来在MC3脂质中引入可降解脂质，既能改善脂质纳米粒的耐受性和代谢速率，同时又不改变其对mRNA分子的递送速率。在MC3的连接键和脂质尾部引入酯键，开发了L319脂质，递送效率更高，肝脏和血浆中的消除也更快。类似结构的SM-102、ALC-0315也相继被开发，并且被分别用于新冠疫苗mRNA1273和BNT162b的处方中，优化了递送效率和药物动力学。

为丰富可电离脂质的多样性，相继开发了含亲水性基团和疏水尾部的脂质，例如C12-200、306O_i10、cKK-E12，用于体内递送mRNA分子。将cKK-E12脂质进行基团替代开发了OF-02，进一步提高递送效率；对OF-02分子结构进行优化开发了OF-Deg-Lin和OF-C4-Deg-Lin脂质，用于肝靶向递送mRNA分子。此外，TT3脂质也用于递送mRNA分子，递送用于编码人类因子IX、CRISPR-Cas9、白介素-12（IL-12）复制子、呼吸系统综合症冠状病毒抗原。FTT5脂质是TT3脂质的可降解衍生物，可以提高用于编码人类因子VIII的mRNA分子。

两性可电离脂质也用于mRNA分子的递送，含pH敏感两亲离子和三条疏水尾链的脂质在内涵体酸环境中聚集成核使膜转变成六边形，利于脂质纳米粒内涵体逃离。

图5 部分可电离脂质结构式

图6 FDA批准上市的首款siRNA药物Onpattro

3.3 其他类型脂质

其他类型磷脂主要辅助磷脂（磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺）、胆固醇、PEG化磷脂，这些磷脂主要用于改善脂质纳米粒的性能，比如稳定性、递送效率、耐受性和生物分别等。

图 7 部分辅助脂质结构式

（1）磷脂酰胆碱

DSPC（二硬脂酰磷脂酰胆碱，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱）是常用的磷脂酰胆碱，DSPC的尾部基团是饱和烷烃链，熔点为-54℃，呈圆柱状形态，在脂质纳米粒中形成层状结构，使脂质纳米粒的结构更为稳定，所以mRNA-1273和BNT162b2这两款新冠疫苗中都使用了DSPC类磷脂。

（2）磷脂酰乙醇胺

DOPE（二油酰磷脂酰乙醇胺，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺）是常用的磷脂酰乙醇胺，DOPE的尾部基团为两条不饱和烷烃链，熔点-30℃，呈圆锥状形态，在脂质纳米粒中易形成倒六边形，引起内涵体膜不稳定，有助于脂质纳米粒内涵体逃逸。

（3）胆固醇

胆固醇能调整脂质膜的完整性和硬度，增强脂质纳米粒的稳定性，而胆固醇衍生物的形态能影响脂质纳米粒的递送效率和生物分布，例如胆固醇类似物疏水尾部基团的链长、固醇环的柔性、羟基的极性等。胆固醇也影响脂质纳米粒的形态，胆固醇衍生物让形成的脂质纳米粒是由脂质划分的多层状多面体结构而非球体形态。

同时胆固醇影响脂质纳米粒对靶点的选择性：含胆固醇油酸酯的脂质纳米粒，对肝内皮细胞的选择性高于肝细胞；含尾部基团被氧化修饰的胆固醇时，脂质纳米粒在肝内皮细胞和Kupffer细胞中的含量高于肝细胞中的含量。

（4）PEG化磷脂

PEG化磷脂对脂质纳米粒的特性有着多重影响：PEG化磷脂的用量影响着脂质纳米粒的粒径和电位；减少粒子聚集而提高脂质纳米粒的稳定性；减少肾脏和单核吞噬细胞系统(Mononuclear Phagocyte System，MPS)介导的粒子清除速率，延长粒子的循环时间；表面的官能团可以用配体修饰，提高靶向递送能力。

摩尔质量和脂质的长度影响着PEG化磷脂的特性，DMG-PEG₂₀₀₀和DSG-PEG₂₀₀₀都是中性磷脂，饱和烷基链的长度分别是C14和C18，但DMG-PEG₂₀₀₀能从脂质纳米粒中更快地分离，利于细胞对纳米粒的摄取和内涵体逃逸，所以DMG-PEG₂₀₀₀的递送效率要优化DSG-PEG₂₀₀₀。

表3 mRNA新冠疫苗的组分

组分/比例	辉瑞/BioNtech	Moderna	Curevac	艾博生物	丽凡达生物
可电离脂质	46%	50%	50%	50%	50%
两性脂质	9%	10%	10%	10%	10%
胆固醇	43%	38.5%	38.5%	38.5%	38.5%
PEG化脂质	1.6%	1.5%	1.5%	1.5%	1.5%