攻破实体瘤，CD4+T细胞或可带来新希望
如果把人体的细胞看做是一个充满复杂运行机制的国家，那么免疫细胞就是这个“国家”的军队。在大名鼎鼎的动漫《工作细胞》中，效应 T 细胞（CD8+T 细胞）被描写成肌肉猛男，辅助 T 细胞（CD4+T 细胞）则承担了“免疫指挥官”这一角色。从细胞的功能看，这两种细胞的“人设”确实很符合军队中士兵与指挥官的职责。
图片来源：漫画《工作细胞》
小百科：CD4 并不是一种细胞，事实上 CD4 是一种蛋白质“标签”，存在于在某些免疫细胞，如T细胞、巨噬细胞和单核细胞表面。具有 CD4“标签”的 T 细胞被称为 CD4+T 细胞，CD8 亦如此
长期以来，科学家们通常认为 CD4+T 细胞的功能是作为辅助 T 细胞，配合 CD8+T 细胞“上阵杀敌”，作为免疫反应中的“配角”，CD4+T 细胞常常被忽略。但在肿瘤免疫中，大多数能够激活抗肿瘤免疫的新抗原，从种类上来说属于主要组织相容性复合体（MHC）I 类限定分子，它们只能被效应T细胞识别。效应 T 细胞作为识别和杀伤癌细胞的主力，自然获得了更多的关注和研究。
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CD4+T 细胞的前世今生
在实际的免疫治疗中，单纯依靠 CD8+T 细胞的免疫作用效果有限，于是科学家才把目光转向了“金牌辅助”CD4+T 细胞的研究。2014 年,《Science》杂志发表了在肿瘤免疫治疗基础上利用靶向特定突变的 CD4+T 细胞疗法，治疗晚期上皮癌的报告。首次证实了 CD4+T 细胞免疫应答的存在。
使 CD4+T 细胞“C位出道”的是在 2019 年一篇发表在《Nature》的文章，一项来自圣路易斯华盛顿大学的研究发现，CD4+T 细胞需要识别 MHC II 类抗原才能被激活，而辅助性T细胞的免疫应答对 CD8+ 效应 T 细胞的抗癌起着重要作用，两种T细胞必须协同作战，才能激活足够强大的抗癌免疫杀伤。文章配发的社论指出：“这很可能是提升免疫检查点抑制剂疗效的关键”。
（两个附着在癌细胞上的 T 淋巴细胞彩色扫描电镜图像，CD4+T 细胞：我们俩嘎嘎乱杀；图片来源：站酷）
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CD4+T 细胞的真正作用
当 CD4+T 细胞功能低下时，免疫功能整体都会受到影响。这是因为 CD4+T 细胞按照功能的不同，可分为 Th1、Th2、Th3、Treg、Tr1、Tfh、Th17、Th9 和 Th22 等 Th 细胞亚群。各大 Th 细胞亚群之间相互协调，共同发挥免疫调节作用，维持机体稳态。
（初始 CD4T 细胞分化方向）
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HIV 感染进程中——“攻防兼备”
HIV 病毒需要在宿主细胞中复制，CD4 细胞是 HIV 病毒的主要靶点。作为“金牌辅助”CD4+T 细胞通常被认为不具备中和感染的能力，而是作为“哨兵”引导并触发机体对病毒的免疫应答，在免疫应答启动后，CD8+T 细胞作为主力“输出”对包括被 HIV 病毒感染的 CD4 细胞在内的感染源实施清除。
在实际应用中，研究人员经过体外试验发现，CD4+ CAR-T 细胞能够有效抑制 HIV 病毒的复制，同时可以破坏被HIV病毒感染的T细胞。此外，接受 CAR-T 细胞疗法治疗的患者，其病毒反弹率较低，肠道 HIV DNA 显著减少，这表明 CD4+ CAR-T 细胞“攻守兼备”。
（CAR-T 细胞疗法在艾滋病治疗中的应用，图源：Biomedicines）
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癌症免疫治疗中——“增益 BUFF”
CD4+T 细胞可通过直接启动细胞溶解机制清除肿瘤细胞，也可间接调控肿瘤微环境靶向肿瘤细胞。此外，在次级淋巴组织中，CD4+T 细胞可增加 B 细胞的数量和质量，以及 CD8+T 细胞的应答。特异性抗原与 CD4+T 细胞相互作用使 DC 优化抗原递呈，并传递特殊细胞因子和共刺激信号给 CD8+T 细胞，CD4+T 细胞还可以通过多种分子机制增强 CD8+T 细胞功能，使 CD8+T 细胞克服抗肿瘤免疫的障碍。
（ CD4+T 细胞和固有信号对 DC 功能和 CD8+T 细胞启动的作用模型）
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实体瘤细胞治疗中——“扫地僧”
从已上市的产品看，CAR-T 疗法的成功更多在血液瘤上，作为入侵 人体这个“细胞王国”的“敌人”，血液瘤更像是“散兵游勇”，分散在血液、淋巴等地方，小股聚集，比较容易被攻击和清除；实体瘤则更像是在某处“山头”安营扎寨的“顽固分子”，打碉堡可比打山寨难多了，所以清除实体瘤相较清除血液瘤更难。最近更是有研究证明，T细胞的另一个分化途径——γδ T 细胞，曾一度被认为天生就为抵抗癌细胞而存在，竟然会“叛变”：驻留在肠道中的 γδ T 细胞本来可以预防肿瘤，然而一旦肿瘤形成，肠道中的 γδ T 细胞群就会发生变化，进入肿瘤并促进肿瘤生长。
（一张自带声音的图片）
基于上述研究，攻破“堡垒”的难度又增加了。此时一项来自 AACR 大会公布的关于 CD4+T 细胞临床试验为我们提供了一个方向，采用基因工程重组的 CD4+T 细胞治疗以往治疗失败或是复发的转移癌，结果显示该治疗安全性好，并对部分患者产生治疗效果。该研究首次证实 CD4+T 细胞免疫治疗对实体瘤有效，或许可成为转移性实体瘤的治疗新希望。
（“辅助”竟变“扫地僧”）
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火热拥挤的 CAR-T 疗法
自 2021 年 6 月中国首个 CAR-T 细胞治疗产品获批上市以来，120 万一针清零癌细胞的疗法火爆全网。
（部分 CAR-T 产品价格一览）
根据 Frost&Sullivan 估计，全球 CAR-T 疗法市场 2028 年将达到 85 亿美元，2019 至 2028 年间市场规模预计呈指数增长，年复合增长率高达 46.1%；中国 CAR-T 细胞疗法的市场规模将于 2024 年增长至 53 亿元，到 2030 年有望增长至 584 亿元，2022 年至 2030 年的复合年增长率为 28.3%。庞大的市场规模带来了大批药企布局，国内的先发企业已经初步完成了关于 CAR-T 知识产权的布局。
除了知识产权外，还要考虑规模化生产中遇到的问题，国内的监管政策也在逐步完善，以“个性化”治疗为特点的 CAR-T 细胞治疗产品如何进行大规模生产，这也是药企和 CDMO 需要共同面对的挑战。
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CAR-T 细胞生产中的难点
与普通的 T 细胞“士兵”相比，CAR-T 细胞像是经过针对性训练的“特种兵”，要想培养一个特种兵，需要花费更多的时间、金钱、精力等，最重要的是，需要建立成体系的、规模化的培养方案。CAR-T 细胞亦如此，目前已获批上市的 CAR-T 细胞治疗产品均为自体细胞治疗，由此采取的“个性化”定制生产方式通常需要 7-15 天完成。在 CAR-T 细胞治疗产品生产中涉及到的T细胞单采、富集、激活、转导和扩增等环节中，每一步都有针对性的质控指标，因此难以规模化生产。其中 CAR-T 细胞的扩增一直是一项备受关注的挑战。
T 细胞扩增培养的条件要求非常苛刻，临床前研究和工艺开发的目标之一就是确定获得高质量细胞的最佳培养条件。但传统的 2D 培养平台不仅在大规模工艺放大过程中存在困难，同时会影响最终产品的质量。以氧气浓度为例，有研究表明在不同氧环境下培养T细胞可对细胞增殖、氧化还原状态和凋亡激活产生显著影响。
在细胞培养阶段阶段迷你平行生物反应器更加适用于工艺设计和优化，通过连接其他过程分析设备，确保最终产品的质量，对培养工艺过程中的物料和工艺的关键属性进行检测以进行设计、分析和控制。在实现高通量工艺的同时确保了数据的丰度，对缩短研发周期和加速产品上市，尤其是在细胞治疗方面有着重要的意义。
（DASbox® 迷你生物反应器系统）
一份迷你生物反应器系统的应用文献描述了三个独立的重复培养实验结果，DASbox® 迷你生物反应器系统平行运行多个独立可控的 BioBLU® 0.3 一次性罐体，顶部磁力驱动实现平稳搅拌，提供均匀分布的营养物质和气体。配以 DASware 系统，严格监控细胞 pH 、DO 和温度等环境，从而依照实验设计保证自动补料系统运行，提供了一个完全可控的培养系统，适合在整个过程中生成高质量的活性和功能性 T 细胞。试验分别在两种不同的氧张力（70% 或 20% 溶氧）下检测人类 CD4+T 细胞的扩增，且在整个实验过程中，每个稀释点的细胞活性是相当的。
试验最终结果显示，在 70% DO 和 20% DO 条件下培养的 CD4+T 细胞第 21 天时的平均扩增倍数分别为 9.63x105 倍和 2.35x106 倍。可以看出与 70% DO 相比，20% DO 对 CD4+T 细胞数量有更积极的影响，同时 DASbox® 还监测到细胞密度调整减少了培养过程中乳酸含量的波动。精细控制这些参数对于维持细胞的健壮状态和促进其增殖至关重要。
更多实验方法和数据
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Eppendorf DASbox® 迷你生物反应器系统在实验室中有操作简单，过程稳定，结果可靠等优势，同时，生物反应器系统在放大生产前就可以通过调控一部分培养条件积累后续放大生产的经验，为从实验室到临床再到规模化生产提供了有力支持。
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