AAV规模化生产平台细胞工艺要点及挑战

全世界有数百项基于病毒载体的基因疗法临床试验项目，其中大约一半使用AAV载体，去年新获批上市的基因疗法中，AAV 基因疗法占比超过 40%。有调研报告显示，AAV 基因疗法药物在未来几年内会持续增长。

AAV 载体具有独特优势，它是一种经过较为充分研究的小型病毒，不会引起人类疾病，可以特异性靶向多种组织，并且在大多数临床情况下仅触发轻微的免疫反应，使它们成为既安全又高效的基因疗法载体。截至目前，国内 AAV 基因疗法 IND 获批至少有二十四款，其中 3 款处于临床 3 期阶段^【1】。这些预示着国内 AAV 基因疗法处于爆发前夕，很快将迎来高速发展期，可以预见，在未来几年内，我们将会看到多款 AAV 基因疗法药物在国内陆续获批上市。

尽管 AAV 基因疗法药物发展前景广阔，但目前 AAV 规模化生产面临诸多挑战，这限制了 AAV 基因疗法药物的临床试验及商业化进程，其中 AAV 生产平台细胞工艺是其面临的难点之一。当前，AAV 规模化生产系统主要有三大类，分别为：三质粒瞬转包装体系、杆状病毒载体包装体系及稳定细胞系包装法。本文简要分析三大生产系统细胞工艺要点。

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三质粒瞬转包装体系

三质粒瞬转包装体系是目前 AAV 生产的主流方法^【2】，所使用的细胞分为贴壁细胞和悬浮细胞。贴壁细胞，例如 293T 细胞系，常被用于实验室里生产小剂量的 AAV 载体，能够满足大多数情况下的科研需求。但贴壁细胞处理起来复杂繁琐、培养过程中易造成污染及不易检测等缺点，不利于将其应用到 AAV 的大规模制备当中。微载体培养技术在一定程度上解决了贴壁细胞的某些上述不足，工艺放大相对容易。而悬浮无血清细胞培养系统，使得 AAV 生产的工艺放大更为容易，且为 AAV 下游纯化减少了负担，并且可显著降低外源污染物污染的风险。

三质粒瞬转包装体系生产 AAV 示意图^【3】

质粒转染，是三质粒瞬转包装体系生产 AAV 很重要的一步，当下有多种质粒转染的方法供选择，但每种转染手段都有各自的局限性。例如，利用磷酸钙转染法，在良好的转染环境条件下，在 293 等细胞中可以达到较高的转染效率，但此方法存在较高不稳定性的问题，其试剂纯度和 pH 敏感性会导致病毒载体生产在批次间存在显著差异^【4】。脂质体转染效率相对较高，但研究表明，脂质体本身会干扰细胞的生理活动，可能会对一些研发数据造成不利影响，但就病毒生产工艺而言，在有效转染剂量条件下，其对细胞毒性相对不大，因此这不是限制规模化病毒载体生产应用的主要因素，但脂质体试剂费用较为昂贵，这是限制其在病毒载体规模化生产中应用的最大障碍^【5】，目前病毒载体规模化生产中使用最广泛的转染试剂是聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI），其主要的优势是价格比较便宜，但其对 pH 的变化较敏感，且对细胞具有一定毒性^【6，7】。

除了转染试剂外，高质量的质粒也是转染生产 AAV 成功的重要因素之一，而质粒往往是在细菌中培养，研究表明，供氧不足会导致细菌代谢异常，质粒的稳定性降低，开环质粒的比例及质粒的聚集程度都会提高。在高密度菌体发酵培养中（高密度菌体发酵有利于提高单位体积培养体系中质粒的产量），系统的供氧效率显得尤为重要。在质粒大规模发酵系统中，供氧效率的提升或优化对质粒质量及产率的提升具有很大的意义，因此，是否具备高效灵活的供氧系统是选择合适生物反应器的重要考量因素之一。

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杆状病毒载体（BEV）包装体系

BEV 包装体系应用携带有 AAV ITR（Inverted Terminal Repeats）及其 rep/cap 基因的杆状病毒载体感染昆虫细胞 SF9，通过在昆虫细胞内表达 AAV 组装所需的蛋白和目的基因等元件，进而组装成成熟的重组 AAV 载体。目前，主要有三种不同的 BEV 包装体系，分别为：三杆状病毒载体系统（Three-Bac）, 双杆状病毒载体系统（Two-Bac）和单杆状病毒系统（One-Bac or Mono-Bac）^【9】。

AAV 杆状病毒载体生产系统示意图^【9】

BEV 包装系统细胞培养工艺中，需要特别注意的因素之一是细胞培养温度，因为昆虫细胞跟哺乳动物细胞对最佳培养温度要求明显不同，昆虫细胞 SF9 在 27°C 至 30°C 之间生长效果最佳。有研究人员，对比了在不同温度下（21、24、27、30 和 33°C）使用三杆状病毒法感染 Sf9 细胞生产 AAV，实验结果显示，在 30°C 条件下，AAV 产量最高。^【10】

此外，杆状病毒与 SF9 的相互作用也会对细胞生理状态产生影响，进而影响 AAV 产品产量与质量，因此，在感染 SF9 细胞时细胞密度，即 MOI 值较为重要，因此，应重点对工艺中的 MOI 参数进行优化。

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稳定整合的细胞系包装法

一些企业和研究机构在进行相应的稳定整合细胞系的开发，由于无需瞬时转染，也就不需要大剂量质粒的供应，减少了手动操作；无需质粒转染或病毒载体（例如杆状病毒载体）感染，同时也就降低了污染风险和相关杂质的引入、去除，从而大大简化了AAV载体制备工艺。例如，专注于高性能细胞系开发和病毒载体制造技术的公司 CEVEC Pharmaceuticals（CEVEC）开发的 ELEVECTA 技术，该技术将所有 AAV 生产所需基因稳定地整合到一个细胞中，成功构建了生产 AAV 载体的稳转细胞系，从而实现无需昂贵的 cGMP 级质粒制备和复杂的转染即可实现大规模 AAV 生产^【11】。

CEVEC的ELEVECTA 技术无需质粒与转染即可实现 AAV 的规模化制备^【10】

虽然稳定整合的细胞系包装法为 AAV 生产提供了一种操作相对简单的规模化生产 AAV 的方法，但需要大量的时间和资源来构建稳定整合目的基因的细胞系，有效地稳定整合是技术难点之一，即在多次传代培养过程中，需保证整合的目的基因不丢失且整合部位不对细胞的正常生理活动产生明显影响。截至目前，很多公司或科研机构因卡在构建稳定整合的细胞系这一步，无法成功，而放弃这一 AAV 生产策略。

总之，上述三大生产体系，有各自的优势与不足，因此，在选择用哪一种体系平台生产 AAV 载体前，需要结合产品需求、生产周期、生产成本、试验需求及目标患者群规模等因素做好评估，选择最适合生产平台。这其中，选择合适的、能简化工艺，且提高再现性的仪器设备也至关重要。

参考资料来源：

1. https://mp.weixin.qq.com/s/HEbbTHIKxwb8BGl0u7_MEw

2. https://www.sciencedirect.com

3. Curr Gene Ther. 2010 Dec;10(6):423-36.

4. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19438300/

5. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19438300/

6. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19438300/

7. https://www.sciencedirect.com

8. https://www.eppendorf.com

9. Biotechnol J. 2021 Apr;16(4):e2000021.

10. https://onlinelibrary.wiley.com

11. https://cevec.com

E.N.D

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