mRNA与CARs技术结合
表达嵌合抗原受体（CARs）的基因工程化免疫细胞，已成为癌症免疫疗法的热门。CAR-T细胞治疗的临床疗效已经在众多实践中得到验证。作为一类新的治疗方式，基于mRNA的治疗方法在mRNA疫苗之外有着巨大潜力。当二者相互碰撞，诞生出一个用mRNA编码CAR工程化改造免疫细胞的技术，是目前癌症及其他疾病一个新的前沿领域。基于此，2023年9月南方科技大学Bin Li团队在Cell子刊《Trends in Biotechnology》刊登了一篇题为“Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology”的综述文章，总结了基于mRNA的CAR免疫疗法最新进展，并强调它们在开发新一代药物方面的机遇和挑战。过去三十年见证了CAR-T细胞疗法的不断发展。根据其细胞内信号内结构域不同，CAR分子已经发展了几代不同的结构，如图1所示。在1989年进行的嵌合T细胞受体的开创性工作的基础上，Zelig-Eshhar和他的同事构建了第一代CAR，T细胞受体CD3ζ链作为细胞内信号结构域。加入来自免疫球蛋白超家族成员（如CD28和ICOS）的含有共刺激结构域的免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM），或TNF受体超家族成员[如4-1BB（也称为CD137）、CD27、MyD88/CD40和OX40]加入CD3ζ的上游，以促进CAR-T细胞的活化和增殖，从而形成第二代CAR，也是目前应用最为广泛的结构，这种CAR使得复发性慢性淋巴细胞白血病和复发性B细胞急性淋巴细胞白血病的患者病情持续缓解。▲图1 基于mRNA表达CAR技术在CAR免疫细胞治疗发展背景下的关键进展时间表2017年，首个CAR-T细胞产品Tisagenleckeel（Kymriah）被FDA批准用于治疗急性淋巴细胞白血病。在接下来的5年里，又有7种针对血液肿瘤的CAR T疗法获得批准。值得注意的是，已获批或在临床阶段的大多数CAR结构为第二代CAR设计，为了进一步提高CAR-T治疗的疗效和安全性，含有额外共刺激结构域的第三代CAR和下一代CAR，如多特异性CAR、药物诱导型CAR、逻辑门控CAR、肿瘤微环境传感CAR和SUPRA CAR正在进行中（图2）。同时，CAR-NK和CAR-M也成为治疗实体瘤当中有前途的候选者。▲图2 嵌合抗原受体（CAR）mRNA构建及其转移和翻译传统CAR-T细胞产品的离体制造过程通常涉及多步骤程序，包括T细胞分离、活化、T细胞工程、扩增和回输（图3），常需要几周到几个月的时间，每次治疗的标价为35万美元到50万美元，具体取决于产品类型和患者的病情。鉴于逆转录病毒和慢病毒载体的高转导效率，在临床前和临床研究中，通常用于CAR免疫细胞的转基因改造（图2）。而睡美人转座子载体与CRISPR基因编辑技术也用于将CAR基因靶向敲入特定基因座来永久表达CAR。然而，由于长期的基因表达和不必要的基因整合风险，对这些方法的安全性担忧变得更加突出（表1）。在利用mRNA转录编码CAR的方法中，电转和mRNA递送载体是其中的代表。与DNA不同，mRNA利用细胞质中的翻译机制产生蛋白质，排除了转基因整合的风险。mRNA可以通过体外转录快速合成，理论上可以用于翻译成任何蛋白质。然而，由于mRNA固有的不稳定性和无法穿过生物膜，其治疗潜力历来被忽视。现代mRNA疗法因递送技术不断发展而受益匪浅。外源性mRNA具有免疫原性，且在没有化学修饰的情况下容易降解。优化策略包括mRNA碱基修饰、优化mRNA UTR和密码子被证明可以降低免疫原性、增强mRNA酸稳定性和翻译能力。从转运的角度来看，带负电荷的mRNA缺乏被动扩散到细胞中的能力，而电穿孔和递送载体可以促进mRNA的内化和运输。目前，这些策略正在应用于CAR mRNA的递送（图3）。▲图3 嵌合抗原受体（CAR）mRNA体外和体内工程化T细胞近年来，非病毒递送方法在基因和细胞治疗中倍受关注。由于CAR mRNA递送载体的可用性有限，长期以来，电转一直是mRNA离体表达CAR的主要方法。为了实现高性能电转，应优化电场和缓冲液等参数。例如，将T细胞暴露于均匀和可调的电场中制造mRNA表达的CAR-T细胞，以靶向癌细胞。最近的一项研究表明，用等渗电转缓冲液抑制原代人类T细胞的特异性DNA传感途径，可以显著降低电转诱导的毒性，并产生比病毒载体更强效的CAR-T细胞。在此主要关注电转在生产基于mRNA的CAR-NK和CAR-M中的应用。NK细胞具有广泛的激活受体，通过天然或抗体依赖性细胞介导的毒性触发癌症细胞的自发裂解，使其成为表达CAR分子的替代免疫细胞。与CAR-T细胞治疗类似，CD19是用于CAR-NK细胞治疗最常见的治疗靶点。早期研究表明，与DNA电转和慢病毒载体转导相比，Anti-CD19 CAR mRNA电穿孔导致CAR-NK细胞阳性水平更高。用Anti-CD19 CAR mRNA电转NK细胞的CAR表达和活性在几个小时内就被检测到，并在电转后持续数天。近年来，CD20、NKG2DL和BCMA也成为mRNA电穿孔CAR-NK细胞治疗的其他有吸引力的靶点。CAR-M是一种新的针对实体瘤的免疫疗法，因为巨噬细胞具有独特的效应器功能，可以渗透到实体瘤组织中并克服靶点的异质性。然而，它们的吞噬活性赋予巨噬细胞对病毒和非病毒载体介导的遗传操纵的固有抵抗力。最近，通过电转巨噬细胞，开发了一种可扩展的巨噬细胞工程方法，其中CAR mRNA具有多重帽结构和碱基修饰，用INF-β启动抗HER2 CAR mRNA电穿孔巨噬细胞，诱导巨噬细胞向M1表型持久极化，并显著增强CAR表达的持久性，最终增强抗肿瘤功能和降低免疫抑制因子的释放。虽然电转一直是体外利用mRNA产生CAR细胞的主流方法，但会导致大量细胞死亡，不适合直接和放大应用。作为电转的替代方案，基于生物材料的mRNA递送载体备受关注，如脂质纳米颗粒（LNPs）、聚合物纳米颗粒和外泌体（Exos），用于CAR mRNA的递送（图2）
LNP是先进的RNA递送平台，已用于三种获批的RNA产品。一种是2018年批准的LNP配方siRNA药物（Onpattro），另外两种是新批准的基于LNP的新冠肺炎mRNA疫苗（BNT162b2和mRNA-1273）。近年来，已经开发了一些新的LNP，用于将CAR mRNA体外递送到免疫细胞。2020年，Upenn的Michael J. Mitchell团队开发了一种名为C14-4 LNPs的mRNA递送载体，用于CAR-T细胞工程。用载有CAR mRNA的C14-4 LNP处理原代人类T细胞，在体外产生了与电转相似的CAR表达和抑癌活性，而细胞毒性显著降低。在另一项研究中，Qiaobing Xu团队开发了两种称为9322-O16B LNPs和76-O17Se LNPs的配方，分别向原代巨噬细胞和CD8+ T淋巴细胞递送化学修饰的CAR mRNA，两种CAR mNRA工程细胞在体外均能显著消除B淋巴瘤。这些结果证明了用mRNA-LNPs体外工程免疫细胞的可行性。除了LNP，其他生物材料，如电荷改变可释放转运蛋白（CART）和外泌体也用于构建基于mRNA的CAR免疫细胞。CART BDK-O7:N7:A13是一种低聚物，有着比电转更高的效率和更低的细胞毒性。该低聚物可用于递送编码抗人CD19/4-1BB/CD3ζ CAR的mRNA，并有效产生CAR-NK细胞，而无需事先激活细胞和改变NK细胞表型。最近，外泌体也被用作mRNA递送的纳米载体。据报道，表达抗CD3/CD28单链可变片段（scFvs）的外泌体可递送CAR mRNA，用于CAR-T细胞的产生和随后的癌细胞杀伤，这证明了用mRNA负载的外泌物工程CAR-T细胞的可行性。体外制造CAR细胞产品既昂贵又耗时，需要复杂的设备和专业知识。为了规避这些限制，生物材料介导的靶向mRNA递送至免疫细胞为体内制造CAR细胞提供了一个有前景的平台。将编码CAR的mRNA靶向递送到特定免疫细胞可以在体内快速产生CAR细胞，消除复杂的离体制造过程。然而，由于LNP的肝脏嗜性，LNP包裹的mRNA向肝外组织和细胞的系统递送一直具有挑战性。为了实现主动靶向，可以将靶向配体或抗体偶联至mRNA纳米载体表面。例如，用抗CD3或抗CD8抗体功能化的聚（β-氨基酯）聚合物纳米载体PBAE-447能够将CAR mRNA靶向递送到淋巴细胞中。▼表2 2019年至2023期间基于mRNA的CAR-T、CAR-NK和CAR-M治疗在临床前和临床发展中的总结通过生物材料介导的体外和体内CAR mRNA递送产生的数十种免疫细胞已在临床前阶段明确证明了其疗效，而需要进一步的临床验证才能保证进一步的临床转化（表2）。目前，除两种抗BCMA CAR-T疗法（NCT04146051和NCT03448978）外，所有基于mRNA的CAR临床试验均基于离体电穿孔，仍处于1期阶段（表2）。间皮素（MSLN）是迄今为止评估的所有肿瘤适应症中最常见的治疗靶点。其他靶标包括BCMA、CD19和NKG2DL（表2）。在过去的30年里，CAR-T疗法取得了巨大的突破，为血液系统恶性疾病患者提供了一种治疗选择。然而，它也带来了外源基因整合的理论风险以及体内不受控制的CAR-T扩增。此外，临床广泛应用还受到复杂制备程序和高昂成本的阻碍。用CAR mRNA工程化免疫细胞能够无整合风险快速、低成本地制造CAR免疫细胞。然而，用于CAR mRNA递送的生物材料的开发仍处于早期阶段，与递送编码mRNA的肿瘤抗原和抑制剂、细胞因子以及用于癌症治疗的CRISPR/Cas9的生物材料相比，其应用在很大程度上尚未探索。到目前为止，还没有启动使用生物材料递送CAR mRNA的临床试验，未来转化研究必须解决几个挑战。首先，与预防性mRNA疫苗相比，CAR治疗需要更高的mRNA剂量和重复给药才能达到持久的治疗效果。为了解决这一挑战，目前正在寻求新技术，如缓释mRNA递送系统、mRNA序列优化、sa/ta RNA以及circ RNA，以降低剂量并延长CAR表达的持续时间。其他挑战包括对冷链储存的要求以及mRNA递送系统的有限递送效率和靶向性，高通量材料和制剂筛选的进步使得先进纳米制剂可以快速开发。此外，通过建模定量结构-活性关系、AI学习来合理设计mRNA及其递送系统，为开发基于mRNA的CAR疗法提供了途径。除此之外，基于mRNA的CAR疗法面临的一个关键挑战是如何开发出高活性的CAR细胞产物，用于治疗实体瘤和其他难治性自身免疫疾病。随着CAR和mRNA技术的技术创新和进步，通过先进的mRNA技术或基于mRNA的CAR治疗与mRNA疫苗的组合对各种类型的免疫细胞进行工程化组合，如趋化因子配体（或受体）、检查点抑制剂、基因编辑工具和其他方法应该增强基于mRNA的CAR治疗的功能，获得广泛的治疗反应和应用。虽然基于mRNA的CAR治疗仍有关键问题需要解决，但我们预计，CAR和mRNA技术的不断迭代改进将加快下一代基于mRNA的CAR疗法的发展，并最终释放其全部治疗潜力，以解决肿瘤学以外未满足的医疗需求。参考文献：
https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2023.08.005