外泌体递送mRNA的包封方法与靶向策略

mRNA在20世纪60年代早期首次被发现，它是基因和蛋白质之间的关键中介。从那时起，科学家在提高mRNA的稳定性和降低其免疫原性方面做了大量的工作。此外，mRNA传递装置的创造也引起了许多研究者的注意。依托两种新冠mRNA疫苗获批，mRNA作为一种新的药物瞬间获得了巨大的发展。如今，基于mRNA的治疗方法在预防性疫苗、蛋白质替代治疗、癌症免疫治疗和基因编辑等方面都显示出了广泛的应用。

在没有递送系统的帮助下，外源性mRNA很难在人体中发挥生理作用，这表明了载体对基于mRNA治疗的重要性。目前，多种纳米材料包括脂质基和聚合物基纳米颗粒被开发出来用于mRNA传递。其中，脂质纳米颗粒已广泛用于临床前和临床试验。尽管对递送平台的研究越来越多，但仍有几大挑战尚未解决，如剂量限制毒性和mRNA向肝外组织的特异性传递。在这种情况下，细胞来源的囊泡，如外泌体（EV），由于其良好的生物相容性、细胞特异性和跨越生理屏障功能，在mRNA传递领域受到越来越多的关注。本文综述了细胞源性囊泡介导的mRNA传递及其在生物医学中的应用。

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外泌体包封mRNA的策略

将mRNA装入细胞来源的囊泡的策略可以简单地分为两大类，即预加载方法和后加载方法（如下图所示）。预加载方法，也称为预分离或内源性加载方法，严重依赖于生物发生过程中生产细胞将mRNA货物打包到EV中。有时，在内源性加载过程中，mRNA编码的蛋白质也会同时被包装成细胞来源的囊泡。预加载方法可以进一步分为被动类别和主动类别。后加载方法也称为分离后或外源性加载方法，此法主要通过电穿孔或化学转染试剂将外源性mRNA装载到分离的EV中。

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两种将mRNA载入外泌体的策略

（一）被动预加载方法被动预加载方法中最常见的方法是将质粒引入生产细胞，以获得转录mRNA。过表达靶标mRNA可促进其在EV中的富集。这种策略已经被几项研究用于将不同的mRNA装载到EV中。例如，低密度脂蛋白受体（Ldlr）mRNA通过在源细胞中强制过表达而被封装到外泌体中。转染质粒后，源细胞中Ldlr mRNA水平比转染对照质粒的细胞增加了100倍以上，从而导致分泌的外泌体中mRNA含量类似的增加。
由于小RNA是分泌的外泌体中RNA的主要形式，将大mRNA封装成纳米外泌体对于被动预加载方法在技术上具有挑战性。结果表明，上述技术不仅提高了外泌体的产量，而且提高了外泌体中的mRNA含量。此外，与传统的电穿孔方法相比，这种策略也导致了mRNA进入外泌体的负荷更高。
（二）主动预加载方法
另一个提高mRNA装载效率的策略是用两种类型的质粒转染生产细胞。一种质粒编码由mRNA结合成分和EV富集蛋白组成的融合蛋白，如表面标志物CD9、CD63，或细胞膜蛋白Hspa8。一般来说，从质粒转录的感兴趣的mRNA包含有意设计的识别位点，它可以与融合蛋白的mRNA形成特异性结合。融合蛋白的剩余部分，即EV富集蛋白，在其生物生成过程中被纳入EVs，以实现活性mRNA的预加载。
靶向和模块化EV加载（TAMEL）是一种主动加载平台，通过将富集EV的蛋白融合到MS2噬菌体外壳蛋白上，主动将mRNA加载到外泌体中。然后将同源的茎环序列整合到mRNA载体中，促进mRNA结合并加载到EV内部。研究发现，这一方法的加载效率会随着mRNA大小的增加而降低。
（三）后加载方法
到目前为止，将mRNA载入EV后，在很大程度上依赖于电穿孔和商业加载试剂。电穿孔是一种常用的将各种分子包括siRNA和miRNA、以及mRNA装载到纯化EV中的方法。大约五分之一的Cas9 mRNA可以通过电穿孔装载到红细胞来源的EV中。此外，一种名为REG1的商业装载试剂也被用于将mRNA在其分离后装载到EV中。

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mRNA靶向表达的策略

为了提高外泌体的组织特异性，人们提出了几种策略，如下图所示。

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基于外泌体的组织特异性mRNA表达平台

（A）miRNA依赖的mRNA表达；

（B）超声波辅助传递；

（C）靶向肽基融合蛋白；

（D）乳清蛋白-磷脂酰丝氨酸相互作用；

（E）酶促共价结合。

（一）组织特异性miRNA依赖的mRNA表达

研究发现，丙型肝炎病毒RNA50端内部核糖体进入位点（IRES）可以被肝脏特异性miRNA-122特异性识别，从而启动其组织特异性mRNA翻译。用其他组织特异性miRNA识别的序列替换IRES上的这个miR-122识别位点，可以使miRNA特异性激活特异性组织中的mRNA翻译。根据这一原理，用PGC1α mRNA编码序列上游的miR-148a识别的序列替换miR-122识别位点，构建了脂肪特异性翻译系统（miR-148a-IRES-PGC1α）。注射这种系统的外泌体可导致小鼠脂肪组织中PGC1α蛋白表达显著增加，但肺、脾和肾表达降低。使用类似的策略，同一组研究也构建了在动脉粥样硬化炎症部位的miR-155富集的miR-122替代炎症反应的Il-10 mRNA。在炎症巨噬细胞中，ml-10mRNA的表达被miR-155特异性激活，而在其他无明显炎症的组织中表达则很少见。

（二）超声辅助组织特异性分娩

为了减少脱靶效应，可以使用超声辅助外泌体传递策略。最近已经建立了两种超声辅助外泌体平台，用于将mRNA特异性传递到脂肪组织。在一项研究中，通过超声靶向微泡破坏（UTMD）和上述所述的组织特异性miRNA依赖的表达系统，实现了EV的靶向摄取。由于超声部位的微泡破坏可能会增强细胞膜的通透性和对受体细胞的细胞摄取，因此UTMD应增加外泌体进入脂肪组织的传递。与这一假设相一致的是，在UTMD的帮助下，UTMD标记的外泌体在脂肪组织中的分布显著增加。

（三）外接靶向肽

通过基因工程、酶学或基于亲和的方法将靶向配体结合到EV上，已被证明对基于外泌体的靶向传递是有效的。例如，当中枢神经系统特异性狂犬病毒糖蛋白（RVG）与外泌体膜蛋白Lamp2b融合时，融合蛋白RVG-Lamp2b促进了EV通过血脑屏障的运输。为了实现EV向脂肪组织的靶向递送，一个脂肪细胞靶向序列（ATS）也被融合到Lamp2b的n端。此外，一个抗HER2单链可变片段连接到一个乳酸黏附素前导序列。前者能够通过抗原-抗体相互作用靶向HER2过表达的细胞，而后者可以通过与其表面磷脂酰丝氨酸的亲和力与EV结合。因此，修饰后的EV被her2阳性细胞选择性地内化.

尽管融合蛋白很直接，但其靶向方法总是需要基因工程。因此，在不进行任何源细胞基因修饰的情况下，将多肽或纳米体共价偶联到EV上，为EV的靶向修饰提供了另一种方法。该通用的靶向平台利用蛋白连接酶催化EV的膜蛋白和靶向配体之间的共价键反应，包括靶向肽、“自身”肽以及纳米体。

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结论与展望

外泌体有望递送各种小分子、siRNA和miRNA。近年来，这些自然发生的囊泡已被应用于mRNA的传递，它们为提高mRNA治疗从肿瘤到COVID-19等多种疾病的疗效提供了一个很有希望的机会。然而，在转化应用之前，还有一些障碍尚未得到解决。包括固有异质性囊泡的关键参数的标准化，如表面特征和自体内容物。此外，在目标器官中的生物分布也值得进一步改进。未来，合理设计工程化的EVs将为开发更有效和更有选择性的细胞源囊泡提供巨大价值，从而加速它们的临床转化。

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