癌细胞下调抗原呈递对于癌细胞逃避免疫系统和癌症发展起到重要作用，如何避免这种情况是目前癌症研究的前沿方向。近日瑞典研究人员利用1型树突状细胞（cDC1）的转录因子PU.1、IRF8和BATF3（PIB）转导人和小鼠癌细胞系，将其诱导重编程为具有cDC1表型的肿瘤抗原呈递细胞（tumor-APCs），该文章已发表在期刊Science Immunology上。
在重编程的9天内，肿瘤APC获得了与cDC1细胞相关的转录和表观遗传信息，恢复了抗原呈递复合物和共刺激分子在肿瘤细胞表面的表达，使内源性肿瘤抗原能够呈递到MHC-I上，并促进CD8+T细胞的靶向杀伤。这类肿瘤APC可以融合和处理蛋白质和死细胞，分泌炎性细胞因子，并向幼稚的CD8+T细胞交叉呈递抗原。人类原代肿瘤细胞也可以被重新编程，以提高其呈递抗原和激活患者特异性肿瘤浸润淋巴细胞的能力。除了获得改善的抗原呈递外，肿瘤APC在体内和体外的致瘤性也受到损伤，将体外黑色素瘤细胞衍生的肿瘤APC注射到皮下黑色素瘤肿瘤中延迟了小鼠的肿瘤生长并增加了存活率，肿瘤APC引发的抗肿瘤免疫与免疫检查点抑制剂具有协同作用。该方法为开发免疫疗法提供了一个平台，使癌症细胞具有处理和呈现内源性肿瘤抗原的能力。
他们先前已经证明了用转录因子PU.1、IRF8和BATF3（称为PIB）可以将小鼠和人成纤维细胞直接重编程为免疫原性cDC1细胞（Direct reprogramming of fibroblasts into antigen-presenting dendritic cells. Sci. Immunol.）。因此假设PIB可以将癌症细胞重编程为抗原呈递细胞（APC），从而提供了一种对抗肿瘤免疫逃避机制和恢复肿瘤细胞免疫原性的策略。为了评估是否可以通过细胞重编程将癌症细胞诱导成抗原呈递细胞，使用慢病毒载体编码小鼠或人类PIB，以及内部核糖体进入位点（IRES）和 eGFP（图1A），转导小鼠癌细胞系LLC和B16，其特征在于MHC表达低。结果表明PIB的表达诱导了两种细胞系中造血标志物CD45和MHC-II的表达（图1B至D），CD45+MHC-II+细胞群被命名为肿瘤APC。在该细胞群细胞内发现cDC1特异性标记物CLEC9A的表达，表明小鼠癌症细胞被诱导为cDC1样表型APC（图1E）。对于人癌症细胞，使用了来自28个人实体瘤的癌细胞系和来自血液恶性肿瘤的5个细胞系。与小鼠细胞中的重编程过程相似，在用PIB转导的所有细胞系中出现了重编程的CD45+HLA-DR+细胞群，但在eGFP转导的对照中没有出现（图1F和G），这表明cDC1重编程普遍适用于小鼠和人类癌症细胞。为了绘制小鼠和人类癌症细胞的总体基因表达变化，在重编程9天后对2个小鼠和17个人类细胞系进行RNA-seq。通过流式分选纯化重编程的细胞，并将转录组与来自小鼠脾或供体外周血的eGFP转导诱导的癌症细胞（第0天）和cDC1进行比较。重新编程的癌症细胞，无论其来源如何，都与天然cDC1有显著变化（图1J），基于在重编程过程中通常上调的cDC1基因产生了肿瘤APC信号，揭示小鼠或人类肿瘤APC产生和与抗原呈递相关的途径，表明重新编程的细胞已经建立了激活T细胞的能力（图1L）。▲图1 重编程诱导小鼠和人癌症细胞中的cDC1程序
2 重编程癌症细胞中的cDC1转录和表观遗传学重塑
人CD45+HLA-DR+或小鼠CD45+MHC-II+细胞最早在用PIB转导后3天出现，并随着时间的推移逐渐增加。利用RNA-seq和ATAC-seq，沿着时间进程描述了人类重编程（CD45+HLA-DR+，++）和部分重编程（CD45−HLA-DR+，+）T98G衍生的肿瘤APC（图2A）。将所有重编程阶段（第3、5、7和9天）与亲代细胞（第0天，eGFP转导的细胞）分离，第7天和第9天更接近外周血cDC1，表明cDC1转录程序是逐步出现的。人类胚胎成纤维细胞（HEFs）的重新编程遵循类似的重新编程轨迹（图2B），表明重编程动力学在恶性和非恶性原代细胞中是保守的。▲图2 PIB诱导快速的全局转录和表观遗传学重编程ATAC-seq差异开放染色质区域的主成分分析表明，表观遗传重塑发生得很快，在第0天和第3天之间发生了重大变化（62%的方差），随后在稍后的时间点（第3、5、7和9天）进行了微调，使细胞更接近cDC1的开放染色质模式（图2C）。为了证实这些结果，使用肿瘤APC基因特征，并沿时间进程绘制了变化图，标记在转录水平上逐渐增加（图2D），并在染色质水平上快速建立（图2E）。这些数据表明，PIB介导的重编程引发了快速的表观遗传学重塑，随后cDC1转录程序逐渐重组。与此相关的是，PIB快速上调cDC1特异性基因的表达，包括ZNF366、CADM1、C1ORF54和CAMK2D，而CLEC9A、XCR1和CXCR3的诱导发生在重编程过程的后期阶段（图2F）。此外，途径、分子功能和生物过程分析显示，IFN-γ信号传导、抗原呈递和处理以及免疫细胞激活最快在第3天富集。在单个基因座的水平上研究了染色质重塑是否是一个循序渐进的过程。与cDC1功能相关的基因在非编程细胞中具有封闭的染色质，如细胞质病原体传感器IFI16，以及cDC1基因ANPPP和IRF8，分别在第3、7和9天显示开放的染色质区域（图2G）。在重编程细胞中开放的染色质区域上的基序发现表明，在第3天富集了PU.1和复合PU.1:IRF8基序，证实了它们在启动cDC1重编程中的主导作用（图2H）。重编程过程中的基序分析（第9天与第3天）揭示了CTCF和BORIS的募集，这是转分化后染色质结构和巨噬细胞功能的重要调节因子，表明CTCF介导的染色质环在重编程期间微调cDC1同一性中有贡献（图2H）。通路分析显示，在第3天至第9天之间可进入的染色质区域富集了与细胞迁移和运动相关的过程，反映了功能的成熟（图2I）。在小鼠肿瘤APC中检测到β-2-微球蛋白（B2M）和MHC-I的表面表达增加（图3A）。此外，人类白细胞抗原（HLA）-ABC和HLA-DR的表面表达在人类T98G细胞中也上调。为了研究肿瘤APC呈递肿瘤相关抗原的能力，对纯化的（CD45+）B16衍生的肿瘤APC和用IFN-γ处理的eGFP转导、未转导和对照细胞，用质谱检测免疫肽与MHC-I的结合表达。与阴性对照和IFN-γ处理的细胞相比，在重编程细胞中检测到更高数量的肽（图3B）。这些亲和力预测肽主要与MHC-I结合，并且平均有9个氨基酸长（图3C）。B16衍生的肿瘤APC显示来源于多种已知黑色素瘤相关抗原肽的呈递增加（图3D）。来源于TYR、TYRP1、TYRP2和p30gag的肽也在亲和力预测阈值范围内，尽管重编程诱导了转录下调，但仍被检测到（图3E）。这些数据表明，肿瘤APC中增强的抗原呈递超过了肿瘤相关抗原的转录下调。
IFN-γ已被用于诱导高水平的MHC I，但在缺乏适当的共刺激的情况下，癌细胞与T细胞受体（TCR）的结合会导致T细胞失去功能，在这里评估了共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达。PIB在小鼠和人肿瘤细胞中诱导共刺激分子的表达，而用IFN-γ刺激癌细胞则没有（图3，F和G）。在人类细胞中，共刺激分子的表达从第4天开始，并逐渐增加，直到第9天。肿瘤APC对TLR3/4触发有反应，导致CD40的表面表达增加，这意味着cDC1重编程赋予癌细胞APC机制来激活T细胞反应。
为了验证肿瘤APC是否呈递内源性异体抗原，利用了卵清蛋白（OVA）细胞系B16-OVA和LLC-OVA证实了OVA表达不干扰重编程，并评估了这两种肿瘤APC的T细胞激活能力，经细胞分选后与幼稚的OT-I CD8+T细胞共同培养，而对照eGFP转导的B16-OVA和LLC-OVA细胞在IFN-γ或聚肌苷酸-聚胞苷酸（Poly（I:C））刺激。与Poly（1:C）处理相比肿瘤APC有效激活了幼稚的OT-I CD8+T细胞（图3，H至J）。此外，肿瘤APC还对CTL杀伤敏感，与未转导B16-OVA细胞相比，肿瘤APC更容易受到CD8+T细胞介导的杀伤（图3，K和L），这表明，cDC1重新编程促进肿瘤抗原呈递，导致免疫识别增强，并通过CD8+T细胞消除癌症细胞。4 重新编程产生引发CD8+T细胞反应的功能性APC
接下来试图通过评估促炎细胞因子的分泌、抗原摄取和向CD8+T细胞的呈递来解决肿瘤APC是否获得了cDC1功能（图4A）。首先评估了肿瘤APC分泌促炎性细胞因子的能力，这是T细胞激活所需的第三个信号。在人细胞中，Poly（I:C）和脂多糖（LPS）的诱导使得肿瘤APC分泌IL12p70、IL-29（IFN-λ）、CXCL10和肿瘤坏死因子α（TNFα）（图4B），表明重编程赋予癌症细胞分泌T细胞募集和激活所需的cDC1相关细胞因子和趋化因子的能力。此外，在小鼠和人肿瘤APC植入后30至60分钟内用OVA–Alexa Fluor 647（OVA-AF647）进行荧光标记（图4C），以研究肿瘤APC是否吞噬蛋白质和死细胞，交叉呈递抗原。通过用甘露聚糖（甘露糖受体的配体）与肿瘤APC孵育测定发现肿瘤APC的抗原摄取是由细胞吞噬介导的。通过荧光检测裂解的DQ-OVA发现肿瘤APC有效地处理内化的抗原OVA（图4D）。在DC中，抗原的有效处理依赖于免疫蛋白酶体的活性，这里也观察到PIB转导的LLC细胞中免疫蛋白酶体亚基PSMB9和PSMB10的蛋白质水平增加（图4E），表明增强的抗原过程是由免疫蛋白酶体介导的。此外，人和小鼠肿瘤APC吞噬了荧光标记的死细胞（图4F），这是依赖CLEC9A参与的交叉呈递DC的标志。随后用OT-I CD8+T细胞评估了重新编程的LLC和B16激活T细胞的能力。用OVA肽SIINFEKL脉冲后，其激活了幼稚CD8+T细胞的增殖，水平与CD103+骨髓来源的DC（BMDC）相当（图4G）。接下来评估了OVA蛋白脉冲后肿瘤APC的交叉呈递，发现肿瘤APC建立了向CD8+T细胞交叉呈递抗原的能力，TLR3刺激进一步增强了这种能力（图4H）。肿瘤APC的一个重要考虑因素是是否可以在人类原发性癌症细胞中引发重编程。该团队从黑色素瘤、肺、扁桃体、舌、胰腺、乳腺和膀胱癌患者来源的异种移植物（PDX）以及肺癌相关成纤维细胞（CAFs）7种不同肿瘤中收集了35份样本。用PIB转导后，所有原发性癌细胞均表现出主要表型变化，启动了CD45和HLA-DR的表达，说明重新编程可行（图5A）。重新编程的效率范围因样本而异（0.6±0.3%至75.2%±6.8%）。来自相同肿瘤类型的样本显示出相似的表型特征，表明患者之间的变异性相对较低（图5B）。为了评估来源于原发性癌症细胞的肿瘤-APC的功能能力，对8个患者来源的黑色素瘤细胞进行了重新编程。在第3、6和9天验证了重编程诱导的表型变化，与先前的研究一致，PIB表达逐渐诱导重编程的CD45+HLA-DR+群体，其激活CLEC9A、CD141、CD11c、HLA-ABC和共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达，黑色素瘤标记物MSCP的表面表达下调，但在第9天仍表达，这与肿瘤相关抗原的呈递一致。重编程的细胞分泌促炎细胞因子IL12p70、IL-29、CXCL10、TNFα、IL-28、IL1β、IL-6和IL-8，这意味着原发性癌症细胞的重编程产生成熟的cDC1样细胞。
为了验证激活幼稚T细胞的能力，用HLA-A2限制性CMV pp65（NLVPMVATV）和MART-1（ELAGIGLTV）肽刺激重编程的黑色素瘤细胞，并将其与从供体中分离的CD8+T细胞共培养，产生了更高的记忆CMV+CD8+T细胞和MART+CD8+T细胞，达到与单核细胞衍生的DC（moDC）相似的水平（图6、A和B）。
用长MART-1肽刺激后，重编程的黑色素瘤细胞诱导T细胞活化，显示原发性肿瘤APC处理和交叉呈递抗原的能力（图6C）。重编程的细胞也可以引发抗原特异性T细胞（图6，A至C），证实了cDC1重新编程赋予原发性癌细胞抗原呈递能力。
▲图6 cDC1重编程在原发性黑色素瘤细胞中显示cDC1功能最后评估了cDC1重编程是否触发从同一患者分离的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）对重编程黑色素瘤细胞的杀伤。结果显示，与eGFP转导和未转导的黑色素瘤细胞相比，和重编程的黑色素癌细胞共培养8小时的TIL增强了CD107a和CD137的表达，并且具有更高的IFN-γ和TNFα的表达（图6D）。此外，与重新编程的黑色素瘤细胞共培养的TIL增加了T细胞标记物BTLA、TIM3、LAG3、PD-1、CD28和CD69的表达（图6E）。在共培养过程中添加ICIs（抗PD-1和抗CTLA-4）导致TIL对重新编程的黑色素瘤细胞的细胞溶解略有增加，这表明将cDC1重新编程和免疫检查点阻断联合治疗会增加疗效。
除改变肿瘤细胞表型外，重新编程癌症细胞也可能减少其增殖并促进有丝分裂阻滞。细胞沿重编程轨迹的RNA-seq显示，与细胞周期相关的基因逐渐下调，这表明cDC1化进程降低了癌细胞的致瘤性（图7A）。与细胞周期相关的基因，如CCNA2、CDK1、MCM6、CDK2、PCNA和MKI67被抑制，抑癌基因TP53、RB1和CDKN1A通过重新编程被激活（图7B）。
大多数癌症细胞系（17种细胞系中的16种）与增殖相关的基因降低，表明诱导细胞周期阻滞与起源细胞类型无关而与重编程相关（图7C）。为了确定这种现象是否反映在体外细胞分裂减少中，用膜染料CellTrace Violet（CTV）标记来源于四个癌细胞系的人肿瘤APC和对照细胞，与对照细胞相比，部分和完全重编程的细胞都减缓了细胞分裂（图7，D和E）。
另外选择了三种在肿瘤抑制基因TP53、PTEN和KRAS中具有突变的癌症细胞系，并评估了它们显示凤尾藻依赖性生长的能力和在软琼脂中形成群落的能力。不难发现由eGFP转导的细胞产生的群落明显多于重编程细胞（图7F），表明致瘤潜力降低。为了验证在体外重新编程的肿瘤APC在体内是否具有抗肿瘤免疫反应的能力。研究团队在同基因小鼠中建立B16-OVA肿瘤模型，并产生B16衍生的肿瘤APC，用OVA蛋白脉冲并用Poly（I:C）刺激。在第7、10和13天将肿瘤APC注射到肿瘤内，与PBS或注射eGFP诱导的B16癌细胞的动物相比，用B16衍生的肿瘤-APC注射延迟了肿瘤生长并延长了存活时间（图8，A至C）。第14天，在外周血中检测到对OVA衍生的和小鼠白血病病毒（MuLV）肿瘤相关抗原衍生肽的MHC-I特异性T细胞频率增加（图8D）。在第18天，还观察到肿瘤引流淋巴结（TdLNs）中PME-反应性CD8+T细胞水平升高（图8E），这表明肿瘤内局部给药的重编程癌细胞足以引发抗原特异性T细胞的扩增，从而控制肿瘤生长。治疗组肿瘤中淋巴群的免疫表型显示，CD8+T细胞和自然杀伤（NK）细胞分别增加了5.5倍和7倍（图8F）。浸润性T细胞（TIL）的进一步表征发现，在肿瘤APC处理的小鼠中，CD44+PD-1+和CD44+PD-1-的CD8+和CD4+T细胞的百分比增加（图8G）。这些结果表明，肿瘤APC足以改变肿瘤微环境（TME），在免疫原性差的B16-OVA肿瘤模型中促进热肿瘤。随后比较了肿瘤细胞与成纤维细胞（MEFs）重编程的APC细胞，在B16肿瘤中的治疗效果，发现在第15天和第18天注射B16衍生的肿瘤APC的动物中肿瘤较小（图8H）。接下来使用低免疫原性B16-OVA模型测试了与ICI组合（抗PD-1和抗CTLA-4）的疗效。肿瘤APC与ICI的结合导致肿瘤生长进一步减少（图8K），与单独治疗相比，延长了荷瘤小鼠的生存期（图8L）。在两只小鼠中发现肿瘤完全消退，肿瘤消退部位的皮肤和毛发褪色（图8M）。这些发现证明了肿瘤APC介导的抗肿瘤免疫与ICIs的协同作用。总之，研究结果支持在体外重新编程的肿瘤细胞获得cDC1在体内对黑色素瘤的抗肿瘤免疫作用。在此证明了PIB介导的直接重编程可以将癌细胞转化为具有抗原呈递和降低致瘤性的免疫原性cDC1样细胞，在癌细胞中PIB的表达驱动了整体转录和表观遗传学重塑，cDC1形态、免疫表型和功能的建立，导致肿瘤抗原呈递。克服了主要的免疫逃避机制，如癌症异质性、抗原呈递丧失和缺乏cDC1。该项研究为免疫疗法的发展奠定了基础，未来可利用脂质纳米颗粒或脂质体等递送方法将PIB原位递送至癌细胞，重编程为APC且降低致瘤性，若该方法得以实现，将会极大降低成本，或是未来多数癌症患者有希望的治疗手段。