【文献解读】Microbiome: 化学法去除宿主DNA以提高唾液样本宏基因组测序质量

                简介                 

标题：Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion [1]

杂志：Microbiome

影响因子：11.6

发表时间：2018年02月27日

解读：很跩的土豆

编辑：很跩的土豆

导读：去宿主是提高宏基因组测序质量的一个不变话题，前面我们已经解读过《Cell Reports》关于痰液样本的去宿主流程，今天我们再次解读唾液样本去宿主方法。在本文中，作者对三种商业化的去宿主试剂盒进行了对比，主要评价试剂盒对宿主DNA的过滤数量。其中，一类渗透溶解（osmotic lysis）和叠氮溴化丙锭（propidium monoazide）处理的方法（lyPMA）被用来处理人的唾液样本。测序数据与人的基因组进行比对，以评估宿主DNA的比例。与未处理的样本相比较，lyPMA能有效去除宿主DNA（8.53%±0.10% versus 89.29±0.03%）。此外，lyPMA处理的样本与未处理样本相比，也具备较低的物种偏好性。

                正文                 

方法部分：

1.    qPCR评估人和微生物gDNA含量

（1）从人的唾液样本中纯化得到总DNA，取1ng用于扩增DNA与评估人和微生物gDNA含量。

（2）其中人特异性引物PTGER2 [2]：

hPTGER2f (5′- GCTGCTTCTCATTGTCTC GG -3′)  

PTGER2r (5′- GCCAGGAGAATGAGGTG GTC -3′)

（3）细菌16S rRNA基因特异性引物 [3]：

Bakt-805R (5′- CCTACGGGNGGCWGCAG -3′)

Bakt_341f (5′- GACTACHVGGGTATCTAATCC -3′)

（4）PCR反应体系：

总体系	10ul
KAPA HiFi Hot- Start ReadyMix (2×)	5 ul
DNA	1ng
Forward Primer	0.5uM
Reverse Primer	0.5uM
1× SYBR green (Life Technologies)	适应体系
dH2O	补足体系

（5）PCR反应条件：

95°C	3min
98°C	20s	35cycles
60°C	15s
72°C	35s
72°C	1min

（6）标准曲线：

人gDNA（提取自HEK293T cells）、细菌gDNA（提取自Escherichia coli)）

人gDNA：细菌gDNA比例：100:0, 25:75, 50:50, 75:25, and 0:100。

2. 去除宿主DNA

（1）流式细胞术

       向20mg冻存粪便加入1ml PBS，vortex10min均质。2000g 3min，2ml PBS稀释后过35-um滤网。取50ul 共3份进行后续实验。2X SYBR green I染色15min，无菌PBS 1:10稀释后流式检测。

（2）超声处理

200ml 唾液样本 40Hz 超声15min（去除细菌生物膜，但不破坏细菌细胞），随后PMA处理。

（3）DNAse处理

未处理的唾液样本使用5500g离心5min，100ul 1× TURBOTM DNase buffer 重悬。加入3U TURBOTM DNAse I，37°C 20min。500ul 1X PBS（含0.1uM EDTA）洗涤样本（抑制DNAse）。

3. 对比研究设计

（1）样本采集和去宿主

样本采集前，1h受试者停止进食和饮水，每位受试者采集4ml唾液。样本vortex 30s，为每种测试方法准备3份样本，每份200ul（共18份），随后立即-20°C储存。

（2）5um滤网过滤（Note：写的是micrometer）

200ul 1X PBS（Note：写的是microliters）加入样本，vortex 15s。稀释液过5-um滤网，滤液-20°C冻存。

（3）MolYsis^TM Basic kit (Mol)

       见操作步骤，去除MolDNase A后，-20°C冻存。

（4）lyPMA

200ul（again: ml in paper）唾液10000g离心8min，弃上清，加入200ul H₂O重新，vortex，室温5min以裂解宿主细胞。10uM PMA（10uL 0.2 mMPMA + 200ul唾液样本），vortex，室温避光5min。样本置于冰上，荧光灯照25min，简易离心5min，-20°C冻存。

（5）NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit

按说明书操作。

4. DNA提取

使用Qiagen PowerSoil DNA kit提取

5. 文库构建和测序（略）

6. 测序数据分析（略）

结果部分：

1. 不同样本中的宿主DNA比例

Fig. 1 宏基因组测序中不同样本类型宿主基因组的比例

黑色点呈现的数据来自人类微生物组计划 (HMP; black) 的健康人群蓝色点呈现的是本研究中的健康人唾液样本 (blue) 。Stool n = 249, skin n = 29, vaginal n = 103, nasal cavity n = 112, inner cheek n = 175, tongue n = 208, gums n = 189, saliva n = 24 (this study)

2. 去宿主方法对比

Fig. 2 不同去宿主方法处理样本后，宏基因组比对结果中的宿主基因组比例。.

One-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison correction, significance p < 0.0001

3. 受试者个体差异驱动唾液细菌菌群分群

Fig. 3 驱动唾液细菌菌群分群的是患者的个体差异，而非去宿主方法。

（a）按受试者着色的样本聚类；（b）按去宿主方法着色的样本聚类；（c）配对的Bray-Curtis聚类差异。within participant, within method (WP-WM); within participant, between methods (WP-BM); and between participants, within methods (BP-WM). Each category is statistically significantly different from each other group (Kruskal-Wallis with Benjamini and Yekutieli FDR correction p < 0.0001)

4. lyPMA对冻存唾液样本的去宿主效果评估

Fig. 4 去宿主和未处理样本Bray-Curtis 距离差异. 

raw-raw n = 22, raw-Fil n = 66, raw-NEB n = 63, raw-Mol n = 63, raw-QIA n = 69, raw-lyPMA n = 69

5. 研究设计概览

Fig. 5 Experimental overview.

总结：低渗理解后PMA处理（lyPMA）是一种新型的宿主DNA去除方法，本方法的对实验器材要求不高，适用于多种DNA的提取。lyPMA能显著提高人唾液样本中微生物序列量。

                参考                 

[1] Marotz et al. Microbiome (2018) 6:42

[2] Alcoser SY, et al BMC Biotechnol. 2011;11:124.

[3]Klindworth A, et al. Nucleic Acids Res. 2013; 41:e1.

                索引                 

【往期文献】

GUT: 新冠病毒病毒活性与COVID-19患者肠道菌群的关系

                后记                 

随着测序技术的不断发展，科学研究进入了数据井喷的时代。然而，测序样本的处理流程、测序数据的分析流程甚至是数据分析过程中的数据库搭建问题，都给测序技术的普及化设置了壁垒，严重阻碍了该项技术向广大科研工作者中推广。此外，基于长读长的三代测序技术的发展更是引入了一套完全有别于二代测序数据处理的分析流程，为了让更多学者认识三代测序、在科学研究中用好三代测序，本公众号应运而生。期待与您一起学习、成长。

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