nature protocol:光遗传法与fMRI技术结合：小鼠脑内植入光纤同步记录钙离子信号与BOLD响应
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来自苏黎世大学的Felix Schlegel等人在nature protocol上发文，其团队研究内容为，如何将BOLD fMRI技术与细胞-特异性病毒传递的GCaMP6（一种遗传编码的钙指示剂，GECI）的光学检测技术相结合。通过在小鼠脑内植入长久性的光纤收集GCaMP6荧光，该荧光在钙结合时增强，则可以在小鼠脑中进行纵向研究。利用此实验方法针对小鼠不同细胞类型，将神经活动与BOLD信号联系起来，进行无任务（静息态）实验和后爪刺激（electrical hind-paw stimulation）实验。采用一般线性模型（GLM）方法，将钙信号作为回归量来拟合BOLD fMRI时间信号。结果表明，在无任务（静息态）条件，局部自发钙信号和BOLD活动之间在两个皮质半球中相关性都是显著的。将后爪刺激实验的荧光信号作为BOLD信号的回归量，发现与后肢同侧区域存在最强的相关性。实验结果突出了光遗传法与fMRI技术结合的优点，该实验方法适用于利用合适的荧光指示剂来研究其他分子过程。
关键词：光纤测光法；BOLD fMRI；一般线性模型；神经元细胞；星形胶质细胞；GCaMP6；光遗传
在动物模型实验中，侵入式电生理记录实验常与fMRI结合并提出有价值的解释，如研究发现BOLD活动与局部场电位（LFP）存在相关性。研究已知BOLD信号的改变代表神经代谢需求的改变，即使在没有任何神经元峰值活动的情况下也会发生这种改变。基于荧光蛋白改进的GECIs的设计已经得到广泛应用。之前研究已证明，光纤钙记录可与BOLD fMRI结合使用。本文实验方案中概述的各种技术进展的目标是，在小鼠大脑中建立起对Ca2 + 和BOLD fMRI的同步记录，以进行长期的纵向研究，从而使研究人员能够解决诸如神经血管耦合等广泛的机制问题。
方法
本文研究者共选用15只C57BL/6 雌性老鼠（2-3月龄），其中10只老鼠为神经元特异性表达的GCaMP6荧光，另外5只为星形胶质细胞特异性表达的GCaMP6荧光。对这15只老鼠按照以下步骤进行实验：1）植入光纤：通过光纤尖端读出钙指示剂荧光性，通常称为“光纤测光法”，是一种从目标区域进行大脑活动测量的简单方法，例如，测量表面的新皮层区域，特别是难以通过普通光学技术检测的深层核区域。2）对Ca2 + 和BOLD信号同步记录：光纤法适合与fMRI技术同时记录，这两种方法不会相互干扰，所有光学探测器和金属组件都可以放置在磁场之外（图1）。3）数据处理：本文采用一般线性模型（GLM）方法，将钙信号作为回归量来拟合BOLD fMRI时间信号。
图1.实验装置示意图
光纤植入
为了测量荧光信号，要在颅骨上安装一个包含光纤末端的套圈，其尖端接触老鼠的大脑皮层表面。与本文作者之前实验类似，可采用短期颅骨窗植入的方案，使硬脑膜保持完整。需注意，对硬脑膜不透明的大鼠，实验设计需使纤维尖端能够穿透硬脑膜。对于大鼠或较大的动物，可采用直径较大的套圈保证机械稳定性。虽然实验者观察到来自光纤植入的稳定信号持续了几个星期，但仍需注意颅骨再生导致的信号质量降低（图2）。
图2.水平光纤植入示意图
实验刺激设置
尽管光纤Ca2 +记录实验通常用在自由行动小鼠的研究中，但由于fMRI中的空间限制和运动伪影敏感性的特点，则需对动物进行固定，从而限制了实验范式的选择。本文采用电子后爪刺激实验，是因为该实验肢体操作简单，且已被广泛用作啮齿动物fMRI研究。改变blocks的刺激频率、幅度和持续时间使外周心血管混合程度最小化。本文选择3 Hz和0.7 mA的8s blocks组成的范式，产生较强的BOLD响应，该响应在躯体感觉区域最为明显。将光纤植入物放置在视觉或感觉皮层上，本方案适合采用视觉或胡须刺激，这两种方法都已应用于啮齿动物fMRI研究。
fMRI 数据采集
采集：采用MRI标准GE-EPI序列记录小鼠脑10个横切面，获得小鼠BOLD数据（feld of view (FOV) = 16 × 7 mm2, matrix dimension = 80 × 35 pixels, slice thickness = 0.5 mm, voxel dimensions ： 0.2 × 0.2 × 0.5 mm3. TR = 1000ms）。在1s /每体素的时间分辨率下，针对高时间SNR优化序列参数。在7 T的场强对磁化率伪影进行优化。
数据分析
该实验方案对Ca2 +记录和fMRI数据的预处理，遵循先前对两种类型数据的常规程序。将这两种方式结合起来的方法取决于具体的研究问题。由于fMRI测量覆盖大脑区域，使得计算Ca2 +记录和BOLD信号体素间的相关性变得可行。本文采用一般线性模型方法，将Ca2 +信号作为回归量来拟合BOLD fMRI时间信号。依据钙指示剂的响应动力学以及细胞内钙动力学，测量得到的荧光信号可代表神经活动的潜在延迟和低通滤波特性。文章采用AFNI、SPM软件包，基本设置与fMRI处理步骤一致，并与GCaMP6指示剂测得的神经元Ca2 +信号卷积，结果适用于BOLD响应模型。结果显示了P <0.001（未校正）阈值的体素。
结果
静息态实验结果（图4）
光纤植入物检测到的体积信号与神经元特异性钙指示剂结合测量时，其灵敏度足以检测出自发钙信号（图4a，左上图）。使用电生理学记录和钙成像，观察到缓慢的皮层振荡。尽管它们的生理意义仍然难以确定，但有研究提出了它们有记忆巩固的作用。在星形胶质细胞内大量Ca2 +信号未观察到自发振荡。荧光信号可作为fMRI数据GLM分析中的回归量。在无任务（静息态）的情况下，局部自发钙信号（与血流动力学反应函数卷积）和BOLD活动，在两个皮质半球之间的相关性强烈显著（图4a，中间和右下）。已有研究采用小鼠皮层的宽镜片光学成像报道了与潜在钙动力学耦合的自发血流动力学事件的类似模式。这种模式在数周的时间内持续存在于同一动物中，3周后重复测量仍存在（图4b，左上和右下）。
图4.来自静息态下长期Ca 2+记录 / BOLD fMRI同时记录的实例数据
电子后爪刺激实验结果（图5）
对于神经元特异性（图5a，b）或星形胶质细胞特异性（图5c）GCaMP6表达的小鼠，显示了初级躯体感觉皮层的后爪区域刺激所诱发的钙荧光反应，同时获得相应的BOLD响应。将刺激实验的荧光信号作为BOLD信号的回归量，发现与后肢同侧区域存在最强的相关性，如前所述，与丘脑也存在相关性（图5d, e为神经元特异性GCaMP6）。在动物中，诱发荧光反应的SNR（定义为ΔF/ F的最大值除以前10s基线的标准偏差）对于神经元相应为6.1±0.6，对于星形胶质细胞相应为5.3±0.7。
图5 电子后爪刺激后同时进行Ca2 +/ BOLD fMRI记录
小结：本文概述同步Ca2 +/ BOLD fMRI信号采集技术的实验方案设计，两种方法互补，非常适合于研究整体系统内神经血管和神经代谢组合的机制，或制定控制干扰实验，如控制药理学物质，不同麻醉方案或不同转基因小鼠疾病模型等实验设计。该实验方法适用于选取合适的荧光指示剂来研究其他分子过程。
参考文献：Schlegel F, Sych Y, Schroeter A, et al. Fiber-optic implant for simultaneous fluorescence-based calcium recordings and BOLD fMRI in mice[J]. Nature protocols, 2018, 13(5): 840.
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