全国猛增超10000家PCR实验室彻底改变了分子诊断的发展走向
来源：IVD学习笔记 信息来源：博德致远
一、分子诊断行业高速发展
社会发展、医疗感染新态势、新冠疫情，为分子诊断行业发展创造了利好因素。
1老龄化，感染性疾病和肿瘤发病率增多
我国60岁以上人口2.64亿，占总人口比例达18.7%，预计到2030年，60岁以上人口会达到3.6亿。随着年龄的增长，人体免疫力下降，免疫力下降导致罹患感染性疾病、肿瘤等疾病的风险增高，疾病筛查和肿瘤早筛等分子诊断的需求增加。
2021年年末，我国常住人口城镇化率为64.72%，预计到2050年将达到71.2%，过快的城市人口增长，人口密集流动接触更加频繁，无形中为传染病的传播和流行提供了有利条件。2003年的非典、2014年的埃博拉、2016年的寨卡、2020年的新冠以及近期出现的儿童不明原因肝炎，都对全球卫生体系提出了新的挑战，病毒变异速度加快导致传染病控制难度加大。
抗生素滥用催生超级耐药微生物，如果不采取有效措施，预计到2050年全球每年将有1000万人死于耐药菌的感染，经济损失将达到100万亿美元，微生物耐药已经成为全球公共卫生危机。传统的细菌培养需要较长的检测时间，大多数病毒在体外难以培养甚至不能培养，而分子诊断可以快速诊断微生物的耐药性，赛沛在2020年推出的Xpert® Carba-R Assay 碳青霉烯耐药基因检测试剂盒，同时报告5大碳青霉烯耐药基因blaKPC，blaNDM，blaVIM，blaIMP和blaOXA-48。
疫情前PCR实验室主要是在大型三甲医院、CDC、科研院所实验室等机构，对人员素质、设备、实验室环境都有非常高的要求。疫情发生以来，二级以上医院加上第三方ICL新建了近10000家PCR实验室，使我国的核酸检测能力短期内大跨步提升，有效缩短了“全民检测时间”。后疫情时代，如何发挥这些“花巨资”建设的PCR实验室功能成为一个新课题，院内通过开展分子诊断既可以解决检测周转时间（Turn-around time，TAT），减少PCR实验室空置问题。
除以上几点外，分子诊断行业发展还有诸如精准医疗、肿瘤早筛、分级诊断等有利因素的影响，在此就不一一展开。
国内分子诊断市场规模从2013年的25.4亿元增长至2019年的132.1亿元，年复合增长率达到31.63%，增速约为全球增速的2.6倍。据有关机构预测到2024年分子诊断行业市场规模将达到330亿元，预计到2030年，分子诊断将超越免疫诊断成为IVD行业最大的市场。
全球市场规模也呈现稳步增长的态势，有数据显示，2013-2019 年全球分子诊断市场规模由57亿美元增长至113.6亿美元，年复合增长率为12.18%。BCC Research报告预计，全球分子诊断市场将从2021年的176亿美元达到2026 年的426亿美元，复合年增长率为19.3%。
自1983年Kary Mullis发明了PCR技术，PCR技术被广泛应用于产前诊断、肿瘤早筛、传染病检测、伴随诊断、耐药性检测等诸多场景。目前市场上分子诊断的技术主要分为PCR技术、基因测序、荧光原位杂交（FISH）和基因芯片四个大类，PCR技术是应用最成熟、市场份额最大，国内获批的分子诊断产品中，基于 PCR 技术的产品超过90%。
下面观点来自笔者多年从业的一些观察与思考，供参考。
目前市面上的快速PCR主要是通过以下几个方面得以实现：
②改良反应容器（即PCR管）：
A. 管壁厚度会直接影响热传导率，极薄的壁厚可优化热传递减少循环时间；
B. 传统PCR管材质为PP，筛选导热更快的材料可以提高热传导速度，有企业及科研院校尝试了硅基、玻璃等导热新材料；
C. 改变PCR管形状增加受热面积，例如赛沛的片状管可提高单位时间热传导效率，其他还有毛细管、微/纳米级微流控流道。
③减小反应体积：PCR反应体积越小，升降温速度更快，精度更高。除了上述改良，更加需要试剂性能的同步提升，快速Taq酶筛选及反应体系优化成为助力快速PCR实现的关键步骤。快速，必须以不降低性能为前提！
市面上出现了很多恒温扩增的产品，他们以检测速度快、设备成本低为噱头，宣称性能媲美PCR技术。恒温扩增方法，基本都存在灵敏度差、特异性不够的问题，引物设计不如PCR简单，试剂成本也高于PCR试剂。
为了弥补恒温扩增性能的缺点，市面上出现了恒温扩增+CRISPR的组合，加大了成本和复杂度。
还有一些恒温扩增+层析条的组合，这种是损失了灵敏度的做法，但可以做低端市场。还有一种免提直扩试剂，这种跳过核酸提取（富集）过程，只为追求操作简化和方便，损失了检测灵敏度，对于要求高敏的应用，容易出现假阴性。
无论是检测性能，还是试剂成本（原料的成熟度和价格），PCR都是无可比拟的，目前科技领域还没有发现真正能替代PCR的技术。
至于PCR仪器成本，早已不是问题。一方面制造成本已经大幅度下降，另一方面，IVD行业的商业模式决定了，在试剂用量面前，仪器成本都可忽略不计。
传统 PCR试剂盒一般需要-20℃左右的冷链储运，以确保试剂有效成分的生物活性。冷链运输成本高昂且很多地方无冷链运输条件，另外试剂反复冻融也会影响检测试剂的性能和保质期。
还有一种办法是对PCR试剂进行冻干，但冻干参数和工艺差异，会造成试剂性能参差不齐。另外，试剂冻干本身会提高试剂生产成本。
目前业内已有厂家开发出常温或4℃液体保存的PCR试剂，通过筛选合适的酶或对酶进行改造修饰，以及改进其他组分的稳定性，使其在不影响性能的前提下可以实现液体保存。
多种病原体或目标基因在同一反应管内同时检出，将大大节省时间和试剂成本，为临床提供更多更准确的诊断信息。想要诊断出病人感染的具体病原体，传统PCR试剂盒每次只能检测1~3靶标，若检测为阴性，则需要更换检测其他靶标的PCR试剂盒，这样效率就大大降低，异常盲目，俗称“大海捞针”。要做到更快确诊、鉴别诊断和排除诊断，就要采用多重检测技术。
多重检测技术的实现，可以通过提高仪器荧光通道数、熔解曲线、芯片杂交、mNGS等方法来实现。
产品开发与应用场景是紧密关联的，临床分子诊断与其他应用相比有极大的区别，临床分子诊断行业想要真正发展起来，必须要洞察临床应用场景的终端需求，才能开发最符合临床使用的产品形态。
样本随到随检
制约TAT的一个重要因素，就是样本的上机方式。市面上常见的PCR仪大多数是48/96孔，这种仪器最开始是为科研实验室而设计的，而不是临床实验室。这类仪器适合批量检测，例如：①同一个样本的不同指标，例如基因分型genotyping等；②不同样本的同一个指标，例如新冠大规模筛查、血液感染筛查。
过去，临床分子诊断场景，因为样本量少，检测指标不多，医院通过凑样本，PCR仪一个星期只开一到两次机，批量上样也能搞定。TAT长达一两周以上，完全不考虑效率。
近些年，情况大为改观。医院各科室开展了各种新的分子指标或检测项目，这对常规48/96孔PCR仪提出了挑战，因为不同指标的扩增反应程序不同，不同指标不可能在一块板子上同步实现扩增反应！病人采样时间随机、检测指标多样化，检测想要做到及时性，48/96孔板检测方式非常不灵活。
摒弃48/96孔板，才能做出更符合临床分子诊断要求的产品！就像生化、化学发光免疫一样，随来随检、急诊样本优先，才能提高样本的处理效率。最早免疫也采用96孔板为主，包括ELISA和板式发光，现在除了在传染病筛查领域还有应用之外，已经基本被淘汰了。
目前市面上95%的PCR仪器设备都是48/96孔，势必也会被淘汰！
2021年8月《新型冠状病毒核酸快速检测临床规范化应用专家共识》中提到“样本检测全过程所需时间明显缩短，且仪器小型化（部分检测系统实现便携式），具有或不具有核酸提取、扩增检测一体化的特点”。
便携小型化仪器需求场景：
① 分级诊疗，一些社区门诊、二级医院、乡镇卫生院等也需要进行分子诊断，但是这些基层医疗机构专业人员欠缺，且医务人员较少；
② 急诊场景，临床检验标本的采集和送检花费了大量时间，如何能最大限度缩短TAT就成为制约急诊医学快速诊断、快速治疗的关键因素；
③ 边境出入境检疫，进出口货物量的增加加大了边境出入境检疫的工作量，同时新型病毒不断出现，增加了检疫的难度，稍有疏忽就会造成严重的经济损失；
除此以外机场、高铁站、港口等人员密集且流动性大的场所以及野战医院等都需要便携、小型化、适度通量、操作简便的分子诊断仪器。
分子POCT省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，在采样现场即可进行样本分析，快速得到检验结果。通常具备系统集成化、小巧便携、操作简易、快速、密闭、适用于多种场景等特点。李克强总理在2020年两会期间提出要尽快研发出无需实验室环境、检测时间更短、手段更便捷、准确率更高、更安全的核酸检测迭代技术。
这是近年来国内外最为热门的领域！国际上有一些分子POCT玩家，市场上认可度比较高的有：赛沛GeneXpert、生物梅里埃 Filmarray，这两家企业在2021年分别销售35亿美元和12.6亿欧元，虽然销售价格昂贵，但因为产品性能和使用简便依然大卖。其他不错的产品还有Roche Liat & GeneMark、QiaStat-dx、Visby，其中Visby是一款无需设备的微流控手持PCR检测卡，操作简捷，30分钟出结果。国内这些年至少冒出了50~60家分子POCT企业，但从严格意义上来讲，普遍处于“难产”状态，要么产品还未真正开发出来、要么难以量产、要么成本太高、要么注册难度太大，总之，市面上还没见到能与赛沛GeneXpert相媲美的产品，国产分子POCT产业化还有很长的路要走。
小型检测设备受制于样本检测通量和自动化程度，市场地位终究只是辅助。IVD行业市场主流还得是大型全自动流水线，其中分子流水线的研发门槛最高，号称行业高地。目前市场基本还是空白，真正的蓝海市场！
全集成，要求核酸检测所有操作全部能自动化完成，中间无需人工操作或干预，包括：自动开闭盖、移液分杯、提取纯化、体系构建、扩增检测。一台机器等于一个PCR实验室。
IVD行业其他领域，血球、凝血、生化、免疫等都已经实现全自动化，唯独分子诊断因为技术门槛和操作流程复杂性还未完全实现和普及。不同于其他IVD产品，核酸分析因为过于灵敏，对样本交叉污染和气溶胶污染是零容忍的，所以除了高难度的机械结构设计，还对气流控制和模块封闭性有很高的要求，这进一步加大了研发门槛。
市面上比较知名的是Roche Cobas 6800/8800核酸分析系统，该款产品为Blood Screening血液筛查（HBV HIV HCV）而设计开发。
① 无法做到样本随到随检，无法应对检测指标的多样性，只能批量检测，应用场景可能仅限于血站和新冠这类筛查性检测；
② 无法解决气溶胶问题，几乎各种试剂耗材、提取、体系构建、扩增都在一个平面上。Roche还算做得不错的，有一定程度分区；国内那些核酸工作站或样本前处理设备，基本都是“大通铺”，一个空间内集成了各种实验操作，设计简直离谱，令人十分愕然，要不是新冠整体阳性率极低，恐怕要出大事；
③ 通量太低。Roche Cobas 6800的通量是 96 results /3 h、864 results/8 h、1440 results/24 h；Cobas 8800的通量是96 results /3 h、1824 results/8 h。整体通量并不算快。国内某发光企业推出的全自动核酸分析系统，100min出第一个结果，200测试/8小时，一小时只能处理25个测试；杭州某公司，通量是32测试/小时。
市场期待样本随机灵活检测、机械结构设计更容易防气溶胶、通量更高的流水线。