前沿进展 | 受激辐射诱导激发损耗新概念及超分辨应用

Original 两万人都爱光学 2023-04-28

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“前沿进展”栏目，旨在介绍科研人员在光学领域发表的具有重要学术、应用价值的论文，促进研究成果的传播。部分论文将推荐参与“中国光学十大进展”评选。

01 导读

近日，华南师范大学詹求强教授课题组在非线性荧光损耗机理及超分辨荧光显微成像领域取得重要进展。提出了受激辐射诱导激发损耗新概念，并利用一对固定的近红外、连续波激光实现了一系列多色纳米探针的光控荧光损耗，损耗效率超过99%，饱和光强低至23.8 kW/cm²，并实现了多色探针的超分辨成像和亚细胞超分辨生物成像，分辨率高达36 nm。相关成果以“Achieving low-power single-wavelength-pair nanoscopy with NIR-II continuous-wave laser for multi-chromatic probes”为题于2022年5月23日发表在Nature Communications上。2022 | 前沿进展

02 研究背景

受激发射损耗（Stimulated emission depletion, STED）超分辨显微技术于2014年获得诺贝尔奖，其原理是在共聚焦显微成像的基础上，引入一束空心环形光，通过受激发射将激发光斑外围的荧光信号损耗掉，从而提高分辨率。与其他超分辨成像技术相比，STED具有光学切片、无需计算重构、可实时成像等优点，是一种纯物理法的超分辨荧光成像技术。

然而，传统STED显微镜存在原理性局限和问题：成像过程通常需要高光强的超快激光作为损耗光束，导致严重的光漂白、光毒性以及技术复杂等问题。此外，每更换（增加）一种不同颜色的探针，STED系统就要更换（增加）一对激光器的波长，超分辨成像需要对多对激光进行空间三维重合和脉冲时延控制的高精度耦合，导致STED超分辨技术的系统复杂度高、成本高，且会导致荧光检测通道之间的信号串扰。这些问题严重限制了STED特别是多色STED超分辨成像技术的应用和普及（图1a）。

图1 a. 传统STED技术要根据不同探针的光学特性调整激发和损耗光波长，系统复杂；b. STExD策略将激发光和损耗光作用于敏化能级，可以用一对激光调控不同光谱探针，系统大大简化

03 研究创新点

为解决以上难题，该团队基于上转换荧光技术提出了全新的思路。上转换荧光纳米颗粒是一种敏化-发光荧光探针，敏化离子吸收激发光能量，然后传递给发光离子发光。抑制敏化离子和发光离子间的能量传递过程就可以切断对发光离子的能量补给，让发光离子“无光可发”，即受激辐射诱导激发损耗机理（Stimulated-emission induced excitation depletion, STExD），如图1b所示。结合上转换发光的多光子非线性泵浦依赖特性，可以实现传统STED所不具有的荧光损耗非线性放大的独特效应，逐级降低高能级荧光损耗所需要的饱和光强。基于此，研究团队使用740 nm的激发光和1064 nm的损耗光在钕掺杂的上转换荧光探针中实现了99.3%的超高损耗效率，损耗饱和光强降低至23.8 kW/cm²，比传统STED探针降低了3个数量级（图2）。

图2 基于钕离子掺杂纳米颗粒的级联损耗放大效应。三光子发光损耗效率超过99%，单光子仅为87%；三光子损耗饱和光强为23.8 kW/cm²，比单光子的降低4.9倍，损耗效率呈非线性放大结合上转换发光一对多的敏化-发光特性，STExD可以利用一对激光实现对多种UCNPs探针的光开关控制。研究团队利用钕离子的敏化传能作用，使用一对固定波长的激光器成功实现了铒离子，钬离子的高效荧光损耗，损耗效率分别超过90%和80%，也分别在镨、铕、铥、铽掺杂的体系中实现了高效的荧光损耗效应，总计实现9种不同光谱探针的同时荧光损耗（图3）。

图3 基于STExD原理，利用单对激光实现了多种光谱探针的高效光开关调控以此STExD新机理为基础，该团队发展了一种基于单对低光强、近红外、连续波激光的多色超分辨显微成像技术（图4a），分别对钕（黄色），铒（红色），钬（绿色）掺杂的上转换荧光探针实现了不同颜色的超分辨成像，原始图像分辨率达34 nm，并进一步实现了钕、钬掺杂的上转换荧光双色超分辨成像（图4a）。通过荧光探针的表面改性和特异性修饰，他们还成功将上转换荧光探针免疫标记到HeLa癌细胞的肌动蛋白纤维，实现了亚细胞结构的超分辨生物成像（图4b）。

图4 基于STExD原理，用一对连续激光器搭建了一套多色超分辨成像系统，比传统多色STED系统大大简化。实现了多种上转换探针的超分辨成像和双色超分辨成像，以及细胞免疫标记超分辨成像，分辨率最高达到34 nm

04 总结与展望

该团队提出了一种受激辐射诱导激发损耗新机理，巧妙地利用上转换荧光的传能发光特性，用一对固定波长的近红外连续激光实现了不同颜色荧光探针的高效荧光损耗，并最终实现了多色超分辨成像和亚细胞超分辨生物成像。

该工作提出的STExD通用发光损耗策略目前虽仅在上转换发光体系中实现，也可以推广到包括下转换探针和传统有机探针在内的各种传能发光体系中，为开发新型探针、解决传统STED技术的问题提供了新的方案。

STExD使用的近红外激发光和近红外二区的损耗光在组织穿透能力上具有显著优势，其低组织吸收和散射的特性为开发低光毒性、深层组织（近红外II区损耗激光）的多色超分辨成像技术奠定了基础，在突破衍射极限的光传感、光遗传学、光刻等前沿领域也具有广泛的应用前景。

华南师范大学研究生郭鑫、蒲锐为论文的共同第一作者，华南师范大学詹求强教授为论文的通讯作者，华南师范大学为第一单位。课题组黄冰如、吴秋生等其他研究生以及瑞典皇家理工学院KTH的刘海春博士、Jerker Widengren教授等合作者参与了该工作。该工作得到了国家自然科学基金、广东省自然科学基金等经费的支持。

论文链接：https://www.nature.com/articles/ s41467-022-30114-z推荐阅读：