科研 | 南京农业大学：水开菲尔联合体转化大豆乳清饮料的代谢动力学及植物化学研究（国人佳作）
编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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本篇文章中，我们采用代谢组学和宏基因组学相结合的方法，研究了水开菲尔联合体生物转化大豆乳清饮料的代谢动力学和植物化学。UPLC-MS/MS和HPLC-ESI-MS代谢产物定量以及OPLS-DA结果表明，开菲尔联合体引起了代谢产物组成的显著变化，并改变了发酵饮料的植物化学成分。生物活性肽类似物、类黄酮和甘油磷脂，包括N-乙酰基-L-苯丙氨酸、乙酰基-DL-亮氨酸、替帕司坦、汉黄芩素、天竺葵素、染料木素、大豆苷元和甘油磷酸丝氨酸（PS），分别合成了甘油磷酸乙醇胺（PE），并对黄酮苷和大豆皂苷进行了降解。此外，该饮料对ACE的抑制率为92.31%，对DPPH自由基的清除率为87.51%。宏基因组序列分析显示，乳酸杆菌、酿酒酵母和膜毕赤酵母是新饮料中的主要微生物类群，因此，这项研究提供了离散的数据证据，证明水开菲尔联合体是一个有效的生物催化剂，将大豆乳清转化为生物活性饮料。
论文ID
原名：Metabolite dynamics and phytochemistry of a soy whey-based beverage bio-transformed by water kefir consortium译名：水开菲尔联合体转化大豆乳清饮料的代谢动力学及植物化学研究
期刊：Food ChemistryIF：6.306发表时间：2021.04通讯作者：董明盛
通讯作者单位：南京农业大学
实验设计
实验结果
1. 优化发酵条件对响应变量的影响
水开菲尔颗粒是一个由细菌和酵母菌组成的联合体，虽然细菌需要相对较高的温度以获得最佳生长和代谢，但酵母通常需要较低的发酵温度以获得最佳的代谢和生化活性，因此，优化过程有助于确定其生长和大豆蛋白质和植物化学物质生物合成和/或水解的最佳发酵条件。我们预计三个自变量（发酵温度（X1）、发酵时间（X2）和接种物浓度（X3）的不同组合对开菲尔联合体的发酵性能有显著影响。有趣的是，pH值和TSP受发酵温度的影响最大，而在接种物浓度为7.5%时，TF、TYC、LAB和AAB计数更依赖于发酵时间（图S1）。结果表明，发酵温度（X1）、发酵时间（X2）和接种量（X3）分别为27.5℃、3天和7.5%时，开菲尔菌群在大豆乳清饮料中的生长和代谢活性最佳。我们对因变量的模型预测值进行了验证，在三次测定中获得的预测值和实验值的结果如表1和表S1所示。总之，优化结果有助于优化工艺条件，为大豆乳清饮料的发酵提供了最佳条件。
表1 采用两变量中心组合设计(CCD)对水开菲尔发酵工艺进行优化
2. UPLC-MS/MS代谢组学数据集
在这项研究中，共有50种最具鉴别能力的代谢物通过初期发育Q1鉴定出来（图1）。这些包括氨基酸、肽和肽类似物、碳水化合物和碳水化合物结合物、类黄酮和类黄酮糖苷、异黄酮和异黄酮糖苷、甘油磷脂和萜烯糖苷。为了了解两个样品中代谢物组成的动态变化，我们通过整合每个代谢物对应的所有箱中的信号强度来量化每个代谢物的离子强度。量化数据表明，开菲尔联合体诱导了生物转化饮料的代谢物组成和植物化学的显著改变，而热图可视化进一步显示了开菲尔发酵饮料中代谢物组成和植物化学变化的动态（图1）。大豆皂苷III、大豆皂苷I和大豆皂苷IV是大豆乳清（SW）中最主要的代谢产物，而N-（1-脱氧-1-果糖基）亮氨酸、甘油磷酸丝氨酸（PS（20:4（5Z、8Z、11Z、14Z）/0:0））和染料木素是水开菲尔发酵大豆乳清（WKFS）中最主要的三种代谢产物。为了进一步研究两组样品间代谢物组成的差异，我们对样品的ESI正离子和ESI负离子模式的UPLCMS/MS数据进行了主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。PCA和OPLS-DA结果表明，SW和WKFS之间的代谢物组成发生了明确的变化（图2），OPLS-DA的p值和变量重要性投影（VIP）秩数据进一步提供了描述性值，其中大豆乳清和开菲尔发酵乳清之间代谢物组成的变化也可以进一步解释。UPLC-MS/MS检测到的50种主要代谢物在投影（VIP）值中具有很高的变量重要性，并且具有很高的准确性（最小质量误差（<5 ppm））。高VIP值（>1.00）表明所有代谢物对预测样品之间的差异有显著贡献；火山图还提供了对数据的更深入的了解，并强调了开菲尔微生物群诱导的SW和WKFS之间代谢物组成的变化。褶皱变化与SW和WKFS之间的绝对值变化相比；值>/=1表示WKFS上调，值<1表示WKFS下调。因此，从现有的数据证据可以推断，水开菲尔联合体是一个有效的生物催化剂，用于将大豆乳清从食品废料转化为具有广泛潜在生物医学应用的高生物活性发酵饮料。
图1 UPLC/MS/MS检测到SW和WKFS中50个主要鉴别代谢物的热图
绿色和红色分别代表代谢物离子强度较低和较高的区域。
图2 用主成分分析(PCA)、(正交)偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)和火山图来说明SW和WKFS中代谢物浓度的变化。
3. 肽类似物、肽和氨基酸
蛋白质水解在发酵饮料中产生多种生物活性肽类似物、短肽和氨基酸。在SW和饮料中，我们检测到的主要肽类似物为N-（1-脱氧-1-果糖基）亮氨酸、N-乙酰-L-苯丙氨酸、乙酰-DL-亮氨酸、γ-谷氨酰酪氨酸、γ-谷氨酰苯丙氨酸和L-异亮氨酸。水开菲尔菌群发酵显著增加了N-（1-脱氧-1-果糖基）亮氨酸、N-乙酰-L-苯丙氨酸和乙酰-DL-亮氨酸的浓度，但发酵饮料中的γ-谷氨酰酪氨酸、γ-谷氨酰苯丙氨酸和乳酸异亮氨酸离子强度显著下降。Nacetyl-L-苯丙氨酸和乙酰-DL-亮氨酸的HPLC-ESI-MS定量进一步提供了WKFS中高浓度肽类似物的证据，而N-（1-脱氧-1-果糖基）亮氨酸浓度的升高可能是由于D-果糖-L-氨基酸相互作用以及微生物酶的蛋白水解活性增加所致。N-（1-脱氧-1-果糖基）亮氨酸的甜味已被证明可提高几种加工食品和天然水果的感官质量，而N-乙酰-L-苯丙氨酸是必需氨基酸苯丙氨酸的代谢物类似物，作为抗抑郁剂有特殊用途；乙酰-DL-亮氨酸已被证明能改善共济失调症状和小脑共济失调患者的生活质量；L-异亮氨酸是异亮氨酸转氨基产生的支链氨基酸（BCAA），据报道，饮食中大量摄入BCAA会增加神经、代谢和心血管疾病的风险；γ-谷氨酰酪氨酸、γ-谷氨酰苯丙氨酸和乳酸异亮氨酸浓度的显著下降可能是由于开菲尔蛋白水解酶将肽水解为游离氨基酸所致（表S2），因此，大豆乳清的生物转化产生了生物活性肽类似物，并消除了新型发酵饮料中的潜在毒性（BCAA）。更有趣的是，发酵也在WKFS中产生大量短肽和必需氨基酸，包括苏氨酸异亮氨酸、苏氨酸色氨酸、苯丙氨酸酪氨酸、异亮氨酸酪氨酸、异亮氨酸脯氨酸、缬氨酸和亮氨酸（表S2）。短肽提供了一些促进健康的益处，如降低胆固醇、降低高血压和血栓风险，以及提供有益的抗氧化作用。L-酪氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-甲状腺素、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸是WKFS中显著产生的关键氨基酸（表S2），这些氨基酸的积累增加不仅改善了WKFS的营养和口味特性，而且改善了其芳香和功能特性。据报道，色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等疏水性和必需氨基酸具有抗氧化活性，对发酵食品的香气有显著贡献，而甲状腺素和赖氨酸的甜味可改善发酵豆酱的口感质量。WKFS中氨基酸和小肽浓度的显著增加证明了开菲尔微生物群的强大蛋白水解活性以及WKFS潜在的营养和健康促进益处。
3.1 碳水化合物和碳水化合物结合物
发酵饮料的碳水化合物含量较低。除了D-山梨醇外，与大豆乳清相比，在发酵饮料中检测到的其他主要碳水化合物和碳水化合物结合物，有6-[4-（羧甲基）-2-羟基苯氧基]-3,4,5-三羟基氧烷-2-羧酸、β-D-葡萄糖醛酸和蜜二糖显著下降（表2），而山梨糖醇是L-山梨糖、D-果糖或α-D-葡萄糖通过果糖和甘露糖途径代谢的产物，它在WKFS中的积累表明果糖和甘露糖途径是发酵过程中重要的活性生物合成途径之一。山梨醇是一种糖醇，由于其低血糖指数（GI）和非致癌特性，在食品工业中常被用作甜味剂、保湿剂、乳化剂、增稠剂或膳食补充剂。D-山梨醇也在肠道中发酵产生短链脂肪酸，有助于改善结肠健康，并表明发酵饮料可以促进结肠健康，高热量的糖降解成低GI的双酚使得这种饮料可能适合2型糖尿病患者。
表2 UHPLC-MS/MS鉴定SW和WKFS中50种主要鉴别代谢物
SW =大豆乳清，WKFS =开菲尔酸乳发酵饮料，评分：这是定量分析每种代谢物鉴定质量的生殖生成Q1评分（0 – 100）：（FS-碎片评分）：碎片评分的范围是0到0。 100表示代谢物碎片离子与碎片数据库中搜索到的离子数据匹配的程度。 FC（倍数变化）：倍数变化与SW和WKFS之间的绝对值变化进行比较； 值> / = 1表示在WKFS中上调，值<1表示在WKFS中下调：VIP =（SW *＆WKFS * = 106）。 VIP =预测中的可变重要性，并且高于1.00的值表明对说明两个样本之间的差异具有高度的相关性。 a由真实标准确定。 b由MS / MS质谱图，精确质量数和代谢组学数据库鉴定。
在发酵饮料中，黄酮苷被水解为各自的苷元，同时产生生物活性黄酮。几种黄酮类化合物和其他多酚在食品和食品中以其天然形式被糖基化或与其他分子结合。先前的研究表明，微生物发酵过程中产生的β-糖苷酶和有机酸会释放糖基化或结合的类黄酮，并产生新的多酚，此外，类黄酮苷元的生物利用度和生物活性均高于其苷元。铁卡洛斯坦、汉黄芩素和天竺葵素离子强度的升高以及由此导致的查尔康素4-葡萄糖苷、天竺葵素3-O-葡萄糖苷、奥卡宁4’-（6’’-乙酰葡萄糖苷）等糖苷的降解可能是由于开菲尔微生物群产生的糖苷酶或有机酸的活性所致。替帕司坦、汉黄芩素和天竺葵素是近年来在生物医学领域应用日益广泛的黄酮类化合物，因为它们具有抗糖尿病、抗氧化、抗菌和抗利尿的特性，并且没有毒性作用。在WKFS中，Maysin 3′-甲醚是主要的黄酮苷类化合物，离子强度增加。Maysin 3’-甲醚是一种水溶性黄酮苷，因其对自由基介导的细胞损伤和脂质过氧化的保护作用而闻名。黄酮苷的代谢降解和黄酮苷元的产生显著改变了发酵饮料的化学成分，提高了发酵饮料的生物活性。
3.3 异黄酮和类异黄酮邻糖苷
大豆异黄酮已被广泛研究，并显示出广泛的有益健康促进特性。大豆苷元和染料木素是检测到的主要异黄酮，而6''-丙二酰染料木素和甘氨酸是在样品中发现的主要异黄酮苷。水开菲尔联合体发酵使大豆苷元和染料木素的离子强度显著增加了一倍，而生物转化饮料中6''-丙二酰染料木素和甘氨酸的离子强度显著下降。HPLC-ESI-MS进一步定量显示，大豆苷元和染料木素的浓度分别从SW中的0.67±0.1 mg/mL和2.91±0.2 mg/mL增加到WKFS中的6.76±0.2 mg/mL和7.17±0.54 mg/mL。异黄酮苷元包括染料木素和大豆苷元，在豆科植物中以糖苷和糖苷结合物的形式存在，异黄酮的糖基化降低了它们的生物活性。WKFS中大豆苷元和染料木素浓度的增加可能是由于开菲尔微生物群产生的β-葡萄糖苷酶水解异黄酮苷所致。一些研究表明，微生物发酵可以将异黄酮苷水解为各自的苷元，提高异黄酮的生物利用度和生物活性。Genistein具有一些众所周知的促进健康的益处，包括改善糖代谢、抗肿瘤活性、抗癌活性、缓解更年期障碍、降低血甘油三酯、低密度脂蛋白水平和雌激素特性，因此，染料木素和大豆苷元离子浓度的显著增加以及伴随的6’’-丙二酰染料木素和甘氨酸浓度的降低，为发酵饮料的巨大生物价值提供了更多的证据。
3.4 甘油磷脂类
LysoPC（18:2（9Z，12Z））和LysoPC（16:0）是样品中发现的甘油磷酸胆碱，而PS（20:4（5Z，8Z，11Z，14Z）/0:0）和PE（18:1（9Z）/0:0）是饮料中检测到的主要甘油磷酸丝氨酸（PS）和甘油磷酸乙醇胺（PE）。WKFS中LysoPC（18:2（9Z，12Z））和LysoPC（16:0）的浓度显著下降，而PS（20:4（5Z，8Z，11Z，14Z）/0:0）和PE（18:1（9Z）/0:0）的离子强度增加。HPLC-ESI-MS定量结果显示，甘油磷酸胆碱（PC）从SW中的6.99±0.51 mg/mL下降到WKFS中的1.37±0.22 mg/mL，而甘油磷酸丝氨酸（PS）和甘油磷酸乙醇胺（PE）的浓度从SW中的1.12±0.151 mg/mL和0.64±0.0151 mg/mL上升到SW中的8.81±0.5851 mg/mL和4.16±0.3151 mg/mLWKFS（表S3）。甘油磷酸胆碱可能通过开菲尔甘油磷酸二酯酶或其他磷脂酶的活性水解为甘油磷酸丝氨酸和甘油磷酸乙醇胺。磷脂酶是参与甘油磷酸胆碱水解的关键酶，而甘油磷酸丝氨酸在细菌中的生物合成涉及到氨基酸丝氨酸与胞苷二磷酸活化的磷脂酸的缩合。除了作为生物膜的主要组成部分，生物膜在脂质信号传导、骨形成和脑稳定性中起着关键作用；据报道，这些甘油磷脂是传递长链多不饱和脂肪酸的重要来源，对胎儿生长和认知发育至关重要，也是重要信号生物分子生物合成的前体。PS已被证明是细胞凋亡过程中的一个重要信号分子，在病毒感染过程中发挥关键作用，特别是防止病毒穿过脑微血管内皮细胞，并在组织损伤过程中调节血液凝固。一般来说，大豆甘油磷酸丝氨酸（PS）和甘油磷酸乙醇胺（PE）更广泛地用作食品补充剂，因此比甘油磷酸胆碱（PC）具有更多的膳食价值。总之，WKFS中高浓度的甘油磷酸丝氨酸（PS）和甘油磷酸乙醇胺（PE）表明该饮料在减少细胞凋亡、治疗病毒感染、老年痴呆和认知功能障碍的治疗以及其他潜在的临床和药理学应用。
3.5 萜苷
豆皂苷II、大豆皂苷III、大豆皂苷I和大豆皂苷IV是样品中检测到的顶级萜烯糖苷，使用水开菲尔转运体对大豆乳清进行生物处理会导致糖基化植物化学物质的离子强度显著降低。开菲尔菌群在WKFS中分泌的β-糖苷酶可能是大豆萜苷水解的主要原因；与其他植物皂苷不同，大豆皂苷具有抗细胞膜的非溶血性以及抗炎活性。接下来，我们利用发酵技术将萜苷水解成糖和苷元（大豆皂苷），先前的研究表明，大豆皂苷元和其他苷元比相应的大豆皂苷具有更好的生物利用度和生物活性。因此，开菲尔菌群对大豆萜苷的水解有可能提高饮料的生物价值。
3.6 有机酸和不变的代谢物
乙酸、乳酸、葡萄糖酸和葡萄糖醛酸是WKFS中发现的主要有机酸（图S2）。这与Kang等人的发现形成了对比，后者报告说柠檬酸和胡椒酸是梅菊（一种发酵大豆产品）中发现的关键有机酸。果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖和水苏糖是大豆中的主要碳水化合物，据报道，乳酸菌通过糖酵解和TCA循环代谢这些糖，在几种传统发酵大豆产品中产生乳酸和其他有机酸，而饮料中的乙酸和乳酸含量与WKFS中乙酸和乳酸菌的相对丰度相关。
WKFS饮料中葡萄糖酸和葡萄糖醛酸浓度的增加可能是由于WKFS中游离产糖氨基酸的氧化脱氨作用所致。据报道，丙氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的氧化脱氨基作用可在发酵大豆产品中产生有机酸和葡萄糖。葡葡萄糖酸具有酸的调节作用和金属螯合作用，而葡萄糖醛酸通过结合作用具有解毒作用，从而帮助溶解和排除体内的毒素。研究表明，开菲尔乳酸菌具有优良的产葡萄糖醛酸能力，从而能够提高饮料的风味和生物活性。研究发现发酵改变了饮料中的大部分代谢物，很少有代谢物不受生物加工的显著影响，而对发酵没有显著影响的代谢物包括前列腺素7 -葡萄糖苷、维那克林、维库溴铵、香草醛苷、香草酸4 -硫酸酯和芍药苷3 -鼠李糖苷。水开菲尔菌群微生物组成的多样性可归因于WKFS的广谱发酵效率。
4. 饮料的宏基因组序列信息与微生物群落多样性
开菲尔微生物群落的宏基因组序列分析表明，乳酸杆菌和醋酸杆菌是发酵饮料中的优势菌属，而酿酒酵母、膜毕赤酵母和布氏酵母菌是发酵饮料中的优势酵母（表3）。饮料中开菲尔菌群的活性通过大豆黄酮、异黄酮、萜苷、蛋白质和甘油磷酸胆碱（PC）的水解以及伴随的黄酮苷元、短肽、肽类似物、氨基酸、甘油磷酸丝氨酸（PS）和甘油磷酸乙醇胺（PE）的生物合成来表征。开菲尔中的乳酸杆菌具有益生菌作用，并产生有机酸，以保存和改善其发酵产品的芳香和生物活性质量；乳酸杆菌还具有β-半乳糖苷酶活性，可将异黄酮苷水解成各自的糖部分和苷元。
另一方面，醋酸杆菌通过磷酸戊糖途径代谢糖类、醇类、糖醇，在其初级代谢产物乙酸外积累大量的山梨醇、抗坏血酸、益生元等多种发酵产物。据报道，使用不同乳杆菌和醋杆菌菌株的食品发酵能使它们产生具有生物医学特性的能力，例如抗炎，抗氧化，抗癌，抗微生物和DNA保护能力。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Dekkera bruxellensis，Pichia spp.）是一种可在不同发酵食品中合成多种胞外酶的酵母，包括蛋白酶、酯酶、脂肪酶、磷酸酶、β-木糖酶、糖苷酶和其他碳酰化酶。在少孢根霉( Rhizopus oligosporus )和解脂耶氏菌( Yarrowia lipolytica )发酵豆制品过程中，这些酶在水解豆渣多糖、蛋白质和多酚等方面发挥重要作用，产生多种代谢产物，改善发酵豆制品的芳香性和生物活性。因此，可以得出结论，开菲尔菌群中酵母和细菌的多样性提供了多种酶和复杂的生物合成和水解途径，解释了生物转化饮料代谢产物组成的剧烈变化和植物化学的显著改变。
表3 饮料微生物群落的16SrRNA及其序列数据
5. ACE抑制和抗氧化活性
我们评估了大豆乳清和水开菲尔发酵饮料的血管紧张素转换酶（ACE）抑制能力，如图3所示，ACE通过将血管紧张素I转化为血管紧张素II（一种血管收缩剂）和失活缓激肽（一种血管舒张剂）来调节血压，因此，抑制血管紧张素转换酶的活性可以降低血压，有助于处理高血压危象。发酵饮料具有较高的ACE抑制活性，这与WKFS中小肽和肽类似物含量高有关，而大豆和大豆制品发酵产生具有抗高血压能力的生物活性肽和蛋白质片段。据报道，半胱氨酸具有心脏保护作用，而丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸均被确定为抗高血压肽结构最后位置的氨基酸，因此，除了肽类似物外，小肽如苏氨酸-色氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、异亮氨酸-酪氨酸、val-val-val和leu-leu-leu的积累可能是WKFS中ACE抑制活性增加的原因。
我们也使用DPPH自由基清除活性测定了大豆乳清和饮料的抗氧化活性（图3）。由于饮料中含有高活性的多酚类物质，包括乌黄素、天牛素、染料木素和大豆苷元，因此饮料具有较强的自由基清除活性。据报道，高含量的生物活性类黄酮与发酵饮料中的高抗氧化和有益健康效应相关。高ACE抑制活性和抗氧化活性进一步验证了新型饮料在生物医学领域的广泛应用前景。
图3 SW和WKFS抑制ACE活性和清除DPPH自由基活性
结论
我们采用水开菲尔联合体将大豆乳清转化为具有高ACE抑制活性和自由基清除活性的生物活性饮料，采用综合宏基因组和代谢组学技术研究了生物转化大豆乳清饮料的代谢动力学和植物化学。结果表明，在最佳发酵温度（27.5℃）、时间（3天）和接种浓度为7.5%的条件下，开菲尔微生物群将大豆蛋白水解为氨基酸、小肽和生物活性肽类似物，而大豆皂苷和黄酮苷水解为各自的苷元。N-乙酰-苯基丙氨酸、乙酰-DL-亮氨酸、val-val-val和leu-leu-leu是产生的肽类似物和短肽，而替帕司坦、汉黄芩素、天竺葵素、染料木素和大豆苷元是新饮料中产生的最重要的类黄酮。
此外，甘油磷酸胆碱被代谢成大豆甘油磷酸丝氨酸（PS）和甘油磷酸乙醇胺。该发酵饮料具有较高的ACE抑制活性和DPPH自由基清除活性，分别为92.31%和87.51%。宏基因组序列分析显示，乳酸杆菌、醋酸杆菌、酿酒酵母、膜醭毕赤酵母和布鲁塞尔德克酵母是新饮料中的主要微生物类群。开菲尔联合体中酵母和细菌的高度多样性为WKFS中SW植物化学物质的降解和多种生物活性代谢物的同时生物合成提供了多种酶和复杂的代谢途径。因此，这项研究提供了离散的数据证据，证明开菲尔微生物素是将SW生物转化为具有广泛潜在营养和生物医学应用前景的生物活性饮料的可行发酵剂。
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