科研 | Talanta：细胞外小泡磷酸化蛋白质组串联富集的简易的“一种物质”策略（国人佳作）

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编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

细胞外小泡（SEVs）是细胞衍生的、膜包裹的纳米级小泡，在许多生物过程中发挥着重要作用。近年来，越来越多的证据表明，SEVs与癌症、老年痴呆症等多种疾病有着密切的关系，利用SEVs中的磷酸化蛋白作为潜在的生物标志物是癌症早期诊断和预后的一个有希望的新选择。然而，目前的SEVs分离技术仍面临许多挑战，如仪器依赖性强、耗时长、纯度不够等。此外，复杂的富集程序和从临床来源获得的低微克量蛋白质在很大程度上限制了SEVs磷酸化蛋白质组图谱的吞吐量和保存深度。在本篇文章中，我们合成了Ti⁴⁺修饰的磁性氧化石墨烯复合材料（GFST），并开发了一种“单一材料”策略，用于从人血清中富集和鉴定SEVs中的磷酸化蛋白质组。利用金属离子与磷酸基团之间的螯合作用和静电作用，GFST在SEVs分离和磷酸肽富集方面表现出良好的性能。通过简单的GFST培养和磁分离，我们在几分钟内可获得接近85%的回收率。分离的血清SEVs的蛋白质组学分析没有磷酸肽富集，结果得到515个蛋白质，比超速离心或共沉淀试剂盒获得的蛋白质大约多1倍。GFST在一种基于材料的富集中的进一步应用使得在530个磷蛋白中鉴定了859个磷酸位点。激酶-底物相关分析揭示了血清SEVs磷酸化蛋白质组中CAMK的富集底物；因此，我们期望这种低仪器依赖性和有限的样本需求可以促进基于SEV的异常激酶和底物转运的临床研究，用于药物靶点发现和癌症监测。

论文ID

原名：A facile "one-material" strategy for tandem enrichment of small extracellular vesicles phosphoproteome译名：细胞外小泡磷酸化蛋白质组串联富集的简易的“一种物质”策略
期刊：Talanta
IF：5.339发表时间：2021.02通讯作者：秦伟捷
通讯作者单位：国家蛋白质科学中心

实验设计

1. 首先制备GO-Fe₃O₄/SiO₂/Ti⁴⁺(GFST)复合材料，然后利用透射电镜对GFST的形貌进行表征；

2. 利用Ti⁴⁺磷酸基团螯合和静电吸附相结合的方法合成一种新的SEV分离复合材料，用超速离心法从HeLa细胞中分离SEV作为模型样品以评价GFST法分离SEV的效果；

3. SDS-PAGE分析（银染）从模型SEV样品、培养后的上清液、洗涤液和吸附在GFST上的洗脱SEV中提取的蛋白质；

4. Western blot分析来评估GFST的量对SEV分离效率的影响；

5. 采用MALDI-TOF-MS分析胰蛋白酶消化α-酪蛋白来证明GFST对磷酸肽的富集能力。

实验结果

1. GO-Fe₃O₄/SiO₂/Ti⁴⁺(GFST)复合材料的制备与表征

GFST的制备程序如方案1所示。首先，我们通过溶剂热反应将Fe₃O₄纳米粒子分散在GO表面；接下来，我们通过溶胶-凝胶反应在GO-Fe₃O₄复合材料上覆盖一层SiO₂，并进一步用NH₂基团对其进行改性。随后，大环螯合剂DOTA–NHS–酯是通过氧化GO-Fe₃O₄上的氨基与DOTA–NHS–酯的琥珀酰亚胺基团反应而与复合材料表面共价结合的。最后，我们通过金属离子的DOTA螯合作用将Ti⁴⁺固定在复合材料上。所制备的复合材料具有氧化石墨烯比表面积大、磁性纳米粒子磁响应好、DOTA螯合性强等优点。因此，金属离子负载量高，易于分离，回收率高。

我们用透射电镜对GFST的形貌进行了表征。如图1所示，GO呈现薄片形式（图1A），并且在溶剂热反应后许多Fe₃O₄纳米颗粒点缀在GO上。Fe₃O₄纳米颗粒呈均匀形状，平均直径约为100 nm（图1B）。我们在溶胶-凝胶组装后的TEM图像中可以观察到完全覆盖GO-Fe₃O₄的二氧化硅壳（图1C）。二氧化硅壳层赋予复合材料氨基，我们可以用DOTA–NHS–酯和金属离子进一步功能化。我们用ICP-OES法测定固定在GFST上的Ti⁴⁺量，如图S1A所示，Ti⁴⁺的负载能力为52.07 μg/mg，比文献中报道的同类材料的负载能力大。由于GO具有较大的比表面积和DOTA的强螯合作用，使GFST具有良好的SEV分离和磷酸肽富集性能。改性后，复合材料的荷电状态从最初的带负电转变为带正电的GFST（图S1B）。因此，与静电中性TiO₂相比，正电荷GFST通过静电吸附和金属磷酸基团螯合的方式捕获负电荷SEV具有明显的优势。GO和GFST的磁性能如图S1C和图S1D所示，用Fe₃O₄纳米粒子修饰GO后，GO具有明显的磁性，可以很容易地从溶液中分离出来。

图1 (A) GO薄片，(B) GO-Fe₃O₄和(C) GFST的TEM图像

 方案1 GFST合成程序的示意图

2. 基于GFST的SEV分离的验证

Ti⁴⁺与磷酸基团的螯合作用已广泛应用于磷酸肽的富集。考虑到SEV被磷脂双层膜覆盖，我们利用同样的Ti⁴⁺-磷酸基团螯合和静电吸附相结合的方法合成了一种新的SEV分离复合材料。我们用超速离心法从HeLa细胞中分离SEV作为模型样品，评价GFST法分离SEV的效果。在使用前，通过TEM和NTA分析对模型SEV进行了表征（图S2）。为了获得基于GFST的SEV捕获的视觉检测，我们使用两种特异性识别常用SEV标记蛋白的抗体进行了免疫荧光实验。如图2所示，绿色（CD81）和红色（TSG101）荧光在与模型SEVs孵育后可在GFST表面清楚地检测到。与此相反，我们在GFST上只发现了极小的背景荧光，而没有与SEV模型孵育，这表明SEV的捕获是高度选择性的。 

图2 荧光图像显示绿色FITC抗CD81抗体和橙色TRITC抗TSG101抗体在GFST表面的SEVs

培养后，几乎所有SEV都吸附在GFST上，富集效率得到提高；同样，我们在洗涤液中几乎找不到蛋白条带。我们认为，在洗涤过程中，由于GO的高比表面积和GFST与SEVs之间通过螯合作用和静电作用的强结合，SEVs的高效捕获和样品损失最小。如图3所示，洗脱的SEV蛋白显示出与原始模型SEV蛋白相似的条带模式，具有良好的样品回收率。我们进一步研究了基于GFST的SEV分离的重现性。我们用SDS-PAGE对三个GFST分离实验的上清液和洗脱液中的蛋白质提取物进行了表征。如图S3所示，我们从三个分离实验获得的洗脱液中提取的蛋白质显示出相同的条带模式，但上清液中几乎没有可检测的条带，表明获得了高度可重复的SEV富集。我们用氨水进一步洗脱捕获的SEV，并用TEM图像进行表征。如图S4所示，洗脱的SEV呈现典型的茶杯结构，直径约为150 nm。结果表明，GFST可以分离出结构完整的SEV，分离过程是可逆的。为了评价静电吸附在GFST基SEVs富集中的作用，我们还使用了带正电的GO- Fe₃O₄/SiO₂/DOTA进行SEV分离，并与带负电的GO进行了比较。如图S5所示，GO- Fe₃O₄/SiO₂/DOTA可富集少量SEV，凝胶中显示TSG101条带，但GO富集SEV后未发现微量TSG101，表明使用带正电材料富集带负电SEV的优势。在GFST通道中发现了更强的TSG101带，这是由于Ti⁴⁺在GFST上的螯合作用和静电相互作用。GFST前后SEVs模型的蛋白质组图谱显示，在GFST富集的SEVs中鉴定的蛋白质有效地覆盖了SEVs模型中蛋白质组的78.1%（图S6），表明GFST可以有效地捕获SEVs用于后续的蛋白质组研究。 

图3 SDS-PAGE分析（银染）从模型SEV样品、培养后的上清液、洗涤液和吸附在GFST上的洗脱SEV中提取的蛋白质

3. SEV分离条件的优化

我们首先根据分离的SEVs蛋白提取物中TSG101的Western blot分析来评估GFST的量对SEV分离效率的影响。如图4A和图S7A所示，随着GFST量的增加，SEV富集效率先增加后降低，可能是由于GFST过量导致混合不足。当GFST浓度为0.5 mg时，富集效率最高可达74.3%。如图4B和图S7B所示，GFST能够在培养10 s后富集50%以上的SEV，这是已报道的最快的；当孵育时间延长到5分钟时，可达到83.1%的富集效率；而我们使用SEV表面标记蛋白CD9也可获得类似的结果（81.2%）（图S7C）。快速高效的SEV富集又一次归因于GFST的大比表面积以及螯合作用和静电作用的结合，与基于超速离心的SEV分离所需的专用仪器和大约8小时的样品处理相比，GFST策略具有明显的优势，具有低成本和高样品吞吐量。与我们之前的研究相比，GFST使隔离时间缩短了约2倍，承载能力提高了4倍。

图4 GFST分离SEVs条件的优化

SEVs模型的分离效率是GFST和孵育时间的函数

4. 血清SEV的分离及蛋白质组学分析

在用SEVs模型证明GFST分离SEV的有效性后，我们进一步用更复杂的血清样品对分离方法提出了挑战。血清/血浆SEV作为生物标志物筛选的重要来源，特别是为了更好地了解免疫介导的肿瘤逃逸和预测患者对免疫治疗的反应，近年来受到越来越多的关注。从人血清、上清液、洗涤液和洗脱液中提取的蛋白经GFST孵育后进行SDS-PAGE鉴定。如图5A所示，高度丰富的人类白蛋白覆盖了血清蛋白质组的通道，甚至上清液和第一洗涤液的通道。然而，随着洗涤次数的增加，人类蛋白会减少，这表明它们会不断地从系统中去除，洗脱后的SEVs有明显不同的蛋白带型。我们使用常用的SEV标记蛋白TSG101（图5B），通过Western blot分析确认这些SEV的特性。上述结果表明，基于GFST的SEVs选择性富集在高复杂样品中仍然有效。从GFST分离的血清SEVs中获得的蛋白质的SDS-PAGE特征表明，三个重复实验中的蛋白质条带模式几乎相同（图S8），表明基于GFST的SEVs分离在高度复杂的样品中仍然有效。我们通过质谱分析进一步表征富集GFST的SEVs的蛋白质组，并将其与常用的超速离心和基于共沉淀的SEVs分离方法获得的蛋白质组进行比较，如图5C所示。我们从三个生物复制的100 μL血清样本中，共鉴定出515个蛋白组，比基于超速离心（274个蛋白质）和共沉淀（253个蛋白质）的SEVs富集方法（支持信息，表S1）获得的蛋白质组多约一倍，比我们以前的结果多34.1%。细胞组分的基因本体分析（DAVIDBioinformatics Resources）表明，细胞外SEVs是GFST富集的SEVs蛋白质组中最富集的项目，但在超速离心和共沉淀分离的SEVs蛋白质组中仅第三和第四富集的项目（图S9）。虽然我们在GFST富集产物中通过荧光和Western blot分析检测到TSG101和CD81，但是在基于蛋白质组学的测试中没有发现这些已知的EV标记蛋白，可能是由于质谱的检测灵敏度有限。为了对三种分离方法获得的SEV蛋白质组进行定量比较，我们将重点放在血清SEV结果中鉴定的蛋白质和ExoCarta数据库中列出的EV蛋白质上。所有361个匹配蛋白质的无标记定量（LFQ）强度（支持信息，表S2）表明，大多数蛋白质在GFST富集产物中显示出比其他两种方法更高的丰度（图S10），表明GFST富集SEV的高富集效率。我们进一步评估了GFST与超速离心（通常采用的SEVs分离方法）相比的富集特异性（图S11），两种方法的典型脂蛋白含量相近，但GFST富集产物的含量略高。GFST富集产物中的脂蛋白污染可能是由于GFST富集的脂蛋白颗粒表面存在磷脂，因此，对于需要高纯度的研究，我们建议使用补充分离方法进一步富集，例如抗体免疫沉淀法，从GFST分离的SEV中去除脂蛋白颗粒。

图5 （A）SDS-PAGE分析（银染）GFST分离的血清SEVs的蛋白质，（B）使用TSG101对GFST分离的血清SEVs进行Western印迹分析，（C）通过超速离心、共沉淀试剂盒和GFST分离的SEVs中鉴定的蛋白质组重叠。

5. 血清SEVs磷蛋白组的单物质富集

我们用胰蛋白酶消化α-酪蛋白来证明GFST对磷酸肽的富集能力。富集前后胰蛋白酶消化α-酪蛋白的MALDI-TOF-MS分析如图S12A所示。由于高丰度非磷酸肽的干扰，富集前我们只能鉴定出三种磷酸肽。经GFST富集后，我们共鉴定出19个磷酸肽（图S12B，表S3A），并且接近一半的已鉴定磷酸肽（9/19）具有多磷酸化位点，这表明GFST对单磷酸肽和多磷酸肽都具有良好的富集效率。为了进一步挑战用于磷酸肽富集的GFST材料，我们使用由β-酪蛋白和BSA的胰蛋白酶消化物（m/m=1:100）组成的更复杂样品。如果没有富集，光谱会被非磷酸肽淹没，并且无法识别磷酸肽（图S13A）。相比之下，三种覆盖β-酪蛋白所有已知磷酸位点的磷酸肽被鉴定为具有高信号强度比，并且在通过GFST富集后能够明显去除非磷酸肽（图S13B，表S3B）。为了进一步研究GFST富集磷酸肽的选择性，以HeLa细胞的全细胞裂解液为真实样品，得到4875个磷酸肽和363个非磷酸肽，富集选择性高达93.1%（支持信息表S4）。以上结果证明，我们的GFST材料不仅可以从标准磷酸化蛋白中富集磷酸肽，而且对复杂的生物样品也有很高的富集效率。

考虑到SEVs的可用性有限和蛋白质磷酸化丰度低，我们采用不同材料或相容性差的方法分别富集SEVs和磷酸肽的串联富集策略可能导致严重的样品丢失，因此，我们提出了基于GFST的单一材料策略，利用Ti⁴⁺与磷酸基团之间的亲和力来富集SEVs和磷酸肽。我们使用同一批GFST直接对GFST捕获的sev进行裂解、消化和磷酸肽富集（方案2），通过使用GFST串联富集SEVs和磷酸肽，我们成功富集并鉴定了血清SEVs中530个磷酸化蛋白的859个独特磷酸化位点（支持信息，表S5）。进一步分析确定的磷酸化位点，我们发现磷酸化丝氨酸（S）、苏氨酸（T）和酪氨酸（Y）的分布分别为52.39%、35.04%和12.57%。苏氨酸（T）和酪氨酸（Y）磷酸化的明显较高比率表明SEVs磷酸化蛋白质组中可能存在不同的激酶和信号通路。我们利用iGPS软件分析了磷酸根周围的位置特异性氨基酸，进一步研究了激酶与底物的相关性。如图6所示，激酶CAMK、STE20、STKR、MAPK和CDK是最受欢迎的，这与先前报道的结果一致，即CAM激酶IIα和STE20激酶SPAK和OSR1是通过SEVs在细胞之间移动的候选货物蛋白。此外，最近的研究表明，在许多癌症如前列腺癌、结肠癌和乳腺癌中发现了高水平的不同类型的CAMK，尤其是CAMKII。因此，SEVs在转运潜在的异常激酶和底物方面所起的重要作用使其成为新药靶点发现和肿瘤监测的重要来源。 

图6 血清SEVs磷酸蛋白质组中最丰富的10种激酶

方案2 “一种材料”富集血清SEVs磷酸化蛋白质组的过程

结论

总之，我们开发了一种新的血清SEVs磷酸化蛋白质组富集和鉴定方法。通过金属离子与SEVs表面磷酸基团之间的螯合作用和静电相互作用，采用GFST方法可以实现高效、选择性的SEVs分离。利用GFST对磷酸肽进行高度相容的串联富集可以显著减少样品损失和处理时间，并且仅使用低微克的蛋白质就可以提高SEVs磷酸蛋白质组的覆盖率。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33298282/

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