科研 | Hort. Res.：bHLH3的异常表达会破坏类黄酮稳态网络，从而导致桑葚果实色素成分差异（国人佳作）
编译：微科盟矫情的农民，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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水果是人们日常饮食的重要组成部分，它提供如维生素、矿物质和膳食纤维等营养物质。水果的颜色、风味和营养价值是消费者接受的主要因素。在植物的生殖器官中，类黄酮/花青素、类胡萝卜素和甜菜碱是三种主要的色素。根据其结构，黄酮类化合物可以分为十几类，包括黄酮醇、查尔酮、花青素和黄酮。花青素是一种水溶性化合物，广泛存在于植物界，是果实和花朵中最重要的色素，使植物组织呈红色至蓝色；花色苷的种类和数量是影响果实品质的主要因素；类胡萝卜素是一种脂溶性类异戊二烯化合物，广泛存在于种子植物中，是光系统不可或缺的组成部分，颜色从黄色到红色不等。与类胡萝卜素和花青素不同，甜菜碱是一种黄色到红色范围的水溶性化合物，仅在石蕊叶类中存在，所有这些色素还具有多种生物活性。黄酮类化合物/花青素由于对人体的健康有影响而具有很高的营养价值；花青素具有广泛的药用作用，如保护肝脏免受损伤、降低血压、改善视力、强烈的抗炎活性和抗癌特性。桑葚在亚洲也很受欢迎，因为它们味道好、颜色鲜艳、营养价值高。和苹果、葡萄、梨一样，桑葚也有白色、黄色、红色和紫色等多种颜色。以往的研究表明，紫色桑葚中含有丰富的花青素，而浅色(黄色或白色)桑葚中不含有花青素。桑葚中参与花青素生物合成的基因已被鉴定并克隆，ANS、F3H1、F3H1、CHI和CHS1的转录水平已被证明与果实成熟过程中的花青素浓度相关；然而，人们目前对桑葚类黄酮途径的调控以及桑葚果实不同颜色的分子基础还不完全了解。在本研究中，我们对不同颜色的桑葚果实进行了代谢组学、转录组学，以及体内外验证，最终确定了bHLH3在桑葚果实色泽调控中的重要作用。
论文ID
原名：Abnormal expression of bHLH3 disrupts a flavonoid homeostasis network, causing differences in pigment composition among mulberry fruits译名：bHLH3的异常表达会破坏类黄酮稳态网络，从而导致桑葚果实色素成分差异
期刊：Horticulture Research
IF：5.404发表时间：2020.06通讯作者：何宁佳
通讯作者单位：西南大学
实验设计
实验结果
1. 桑葚果实中黄酮类化合物含量和成分的差异是造成果实颜色差异的主要原因
本研究选择Morus notabilis C.K. Schneid (CS)、Morusalba L. cv. Hongguo2 (HG2)和M. alba L. cv. Baiyu-wang (BYW)为研究对象，HG2果实为深紫色，富含色素，CS果实为黄色，BYW果实为白色（图1a），我们对果实进行LC ESI MS/MS代谢组学分析，并对得到的数据进行了主成分分析(PCA)。在PC1× PC2评分图上，可以看出三组(CS、HG2、BYW)明显分开(图1b)。为了识别与果实颜色差异相关的差异积累代谢物，我们用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的得分图来分析样本对之间的差异。在OPLS-DA负荷图上，负荷离原点较远的代谢物对分类的贡献最大；有机酸、脂类和黄酮醇是三种桑葚果实分离的主要因素。花青素是CS和HG2以及HG2和BYW分离的重要贡献者(图1c)。从总体上看，3个品种之间含量差异较大的化合物有103个，其中1 / 3为黄酮类化合物。我们通过热图聚类分析揭示了3个品种之间黄酮类化合物含量的差异。分析表明，紫色果实(HG2)的花青素含量最高，而黄色果实(CS)和白色果实(BYW)的黄酮和黄酮醇含量最高(图1d)。
接下来，我们比较了三个品种的果实转录组。通过转录组从头组装来构建转录本，经过数据清理和严格的质量检查，我们总共获得了4400万-5600万的clean reads，最长的转录本被认为是功能基因。在PCA分析中，CS、HG2、BYW明显分为三组(图1e)。我们鉴定了3个品种间的差异表达基因(DEGs)，并将其定位到KEGG数据库。HG2果实中参与花青素合成的苯丙氨酸代谢、类黄酮合成和苯丙素合成途径显著增强，而BYW果实中类黄酮醇途径较CS显著增强。
图1 不同颜色桑葚果实的代谢组和转录组分析
（a）三个品种CS（黄色），BYW（白色）和HG2（紫色）表型统计；（b） CS，BYW和HG2果实代谢物谱的PCA结果；（c）OPLS-DA图；（d） CS，BYW和HG2中类黄酮代谢物的层次聚类；（e）三个品种转录组PCA结果。
2. 结合代谢组学和转录组学分析揭示桑葚类黄酮途径代谢通量的重定向
基于转录组结果，我们鉴定了参与类黄酮合成相关基因，我们发现虽然在代谢组结果中检测到翠雀素衍生物（DEL），但是并没有发现编码DEL生物合成且属于CYP75A亚家族的F3’5’H同系物。与此同时，我们发现了两个CYP75B亚家族的两个酶基因CYP75B1和CYP75B2，我们通过酵母菌株异源表达CYP75B1，CYP75B2发现，两个CYP75B基因的产物在3'位置均表现出典型的催化活性，能将柚皮苷和山奈酚分别转化为圣草酚和槲皮素，且发现CYP75B基因产物不能羟化二氢山奈酚的3'位置，只有CYP75B1基因产物可以将芹菜素转化为木犀草素。在此基础上，我们对桑葚类黄酮合成途径进行了重组，如图2所示。
后期(LBG)花青素合成基因(UFGT、ANS、DFR和CYP75B1)在果实中的表达在CS和BYW中明显低于HG2(图2)；相应的，CS和BYW的果实花青素含量也明显低于HG2。花青素占HG2中黄酮类化合物的46%，仅占CS和BYW中黄酮类化合物的13-15%。DFR编码一种在花青素形成后期至关重要的酶，该基因上游的第一个分支是黄酮醇生物合成途径。由于CS和BYW中的类黄酮结构基因的转录水平较低，因此CS和BYW中的黄酮醇，花色苷，儿茶素及其衍生物的水平低于HG2。而黄酮类化合物含量最高的是CS，黄酮类化合物在总黄酮中所占比例远高于HG2和BYW。两个基因FLS和FNS的转录水平分别与高黄酮醇和高黄酮水平相关，黄酮醇在3个品种中占总黄酮的比例最高。FLS在BYW中的表达量最高，在三个品种中黄酮醇在总黄酮中所占的比例也最高。FLS在CS中的表达最低，表明CS中黄酮醇的碳通量相对于BYW是有限的。这将导致一些碳通量被转移到上游分支。黄酮的生物合成是黄酮醇合成途径的上游，由FNS控制。FNS在CS中的最高表达导致碳通量流向黄酮分支，这也解释了为什么三种桑葚中CS的黄酮含量最高。
图2 桑葚中黄酮类生物合成途径
C，CS；H，HG2; B，BYW。每个色块代表每个途径基因的平均log 2（RPKM）值。虚线箭头表示未鉴定的酶。将每个品种中的总黄酮（黄酮，黄酮醇，儿茶素衍生物和花色苷）设置为100％，以定义每种黄酮类的相对比例。
3. 桑葚色素沉着过程中涉及类黄酮途径的转录因子及其转录模式
我们分析了类黄酮途径中涉及到的转录因子，总共筛选出八个相关的基因（图3a）。系统发育分析表明，MYBA和MYBF分别与AtMYB113和AtMYB111具有高度相似性；TT2L1，TT2L2和TT2L3属于亚组5家族；IIIf亚组中有两个bHLH蛋白，即bHLH3和GL3（TT8进化枝中的bHLH3和GL3进化枝中的GL3）；TTG1是AtTTG1的同源蛋白（图3a），所有八个基因的产物都位于细胞核中。
接着我们对HG2和BYW中的黄酮合成相关结构基因和转录因子调控基因进行了qRT-PCR分析。结果表明，在果实成熟后期，除CHS2以外的所有花色苷生物合成基因均在HG2中高表达，而在BYW的早期和中期几乎无法检测到它们的表达（图3b）。bHLH3的转录水平与花青素相关基因的转录水平高度相关，而MYBA的表达在HG2和BYW之间无差异。MYBF和两个FLS基因在果实成熟的中期显示最高的转录水平；相反，ANR在两个品种成熟末期表现出最高的转录水平，而在果实成熟期间，LAR的转录水平发生波动。在HG2中，GL3，TT2L2和TT2L3的转录模式与LAR相似。
图3 与桑葚类黄酮合成相关的转录因子(TFs)及其在果实色素沉着过程中的基因表达模式
（a）桑葚和其他物种中候选TF 的系统发生分析；（b）桑葚中类黄酮生物合成相关基因的转录谱。
4. MBW复合物中不同调节因子之间的相互作用
图4 MYB-bHLH-WD40复合物中不同调节因子相互作用的验证
（a）酵母双杂交测定。-W/-L：SD-Trp-Leu介质；-W-L-H-A(X-gal)：SD-Trp-Leu-His-Ade+(X-a-Gal)介质。（b）双分子荧光互补测定。（c）烟草中分裂解荧光素酶互补测定。比例是100 μm。L: Gly/Ser连接，rbs：转录终止子，数据代表四个实验的平均值。星号(*) 表示实验组与对照组之间的差异有统计学意义。(t检验 *P< 0.05, **P < 0.01)。（d）酵母三杂交测定。将MYBA和MYB4插入载体pGADT7。TTG1在MCS I处重组至pBridge；在MCS II处重组bHLH3或GL3至pBridge。在含有指定浓度3-AT(0和30 mM)的SC-Leu-Trp-Met-His培养基上分析相互作用。转化的酵母细胞在培养基上稀释10倍、100倍和1000倍。
5. 参与黄酮途径调控的转录因子的功能分析
我们利用酵母单杂实验鉴定候选MYB和bHLH与ANS，LAR和FLS1启动子的特异性结合。结果表明，MYBA和bHLH3直接与ANS启动子结合，TT2L1，TT2L2和GL3与LAR启动子相互作用，仅MYBF与FLS1启动子结合（图5a）。接着我们在烟叶中进行了双荧光素酶报告基因测定，结果如图5b所示，MYBA对ANS启动子具有弱活性，但是当与bHLH3相互作用时具有强活性。与MYBA、bHLH3、TTG1组合时，ANS启动子活性最高，而当与GL3相互作用时，TT2L1和TT2L2对LAR启动子具有高活性；当TTG1，TT2L2，TT2L2三者结合时具有最高活性（图5c）；相反，MYBF没有影响bHLH3，GL3对FLS1的启动子活性（图5d）。同时，我们培养过表达这些候选TF的转化烟草系以验证其功能（图5e-g）。与带有空载的对照植物相比，过表达MYBA和bHLH3能够增加花青素的积累，而表达其他TF的植物则没有出现该现象，叶片仍然呈绿色。烟草中过表达TT2L1、TT2L2和MYBF降低了花中花青素的含量。与对照相比，TT2L1或TT2L2转化植株积累了大量的PAs，而MYBF在烟草中过表达增加了黄酮含量。
图5 涉及类黄酮生物合成调节过程的调节因子的功能分析
（a）酵母单杂交检测。–Leu: SD-Leu介质。在有AbA175、AbA250和AbA225存在的SD-Leu培养基上筛选结合。（b–d）烟叶中双重荧光素酶报告基因分析。这些数据代表四个实验的平均值。使用单因素方差分析确定处理之间的显著差异(P< 0.05)。（e）携带MYBA，bHLH3，GL3，MYBA / bHLH3和MYBA / GL3的转基因烟草的表型。比例是1 cm。（F）通过半定量RT-PCR确定阳性转基因品系。NtActin作为内部标准。（g）转基因烟草植物叶片中总花色苷含量。星号(*)表示实验组与对照组差异有统计学意义(t检验，***P < 0.001)。
6. bHLH3在类黄酮生物合成的转录调控中不可或缺
进一步分析候选TF对类黄酮途径基因（CHS2，CHI，F3H，FNSI，CYP75B1，CYP75B2，FLS3，DFR，UFGT和ANR）启动子活性的影响（图6a）。有趣的是，两个TT2型TF（TT2L1和TT2L2）与bHLH3结合以激活CHS2，F3H，CYP75B1，CHI和DFR的启动子，MYBA还与bHLH3结合以激活CYP75B1和UFGT。值得注意的是，bHLH3的参与是激活大多数启动子所必需的，包括CHS2，CHI，F3H，CYP75B1，DFR和UFGT。接下来，我们将9个花色苷和55个转录本进行相关性网络分析（图6b）。尽管MYBA与bHLH3结合以激活ANS的启动子并在烟草中产生过量的花色苷，但只有bHLH3在连接网络中与花色苷化合物和花色苷途径基因高度相关；此外，转录组数据还显示，MYBA，bHLH3在HG2和BYH之间没有差异（图S5a，b）。在拟南芥tt8突变体中过表达bHLH3能够将种皮的棕色恢复为野生型（图6c，d）。
接着我们选择了六个桑葚品种的成熟果实，以进一步分析bHLH3转录与果实色素沉着之间的相关性（图6e，f）。在富含色素的HG2，LJ109和D10果实中，ANS的转录水平较高，而在BYW，HGDBZZ和ZZB的白色果实中，检测不到或转录水平较低。bHLH3的表达模式与ANS相同，但MYBA的转录无明显差异。通过qRT-PCR我们确定了F2群体中bHLH3的表达特征（图6e，f）。bHLH3的转录水平在F2-R中最高，其次是F2-P，在F2-W中最低，与ANS的转录模式相同，而MYBA的表达水平仍没有显著差异。为了进一步研究bHLH3在淡色果实中低表达的原因，我们分析了bHLH3在CS、BYW和HG2中的启动子序列，因为顺动元件是决定基因表达的主要因素。出乎意料的是，除了CT重复元素（富含5'-UTR Py的片段）外，没有发现与果实色素沉着相关的显着SNP位点。“5 -UTR Py-richstretch”元件通常与增加基因表达有关，在富含色素的果实中最长，在浅色果实中最短。我们将来自CS、HG2和BYW的bHLH3启动子与GUS连接并转化到烟草叶片中，检测CT-repeat元件是否影响表达，发现瞬时表达三种bHLH3p:GUS结构体的叶片具有相同的GUS活性。
图6 bHLH3是激活类黄酮生物合成不可或缺的因子
（a）双荧光素酶报告基因检测表明，CHS2、CHI、F3H、CYP75B1、DFR、UFGT启动子的激活需要bHLH3的参与。这些数据代表四个实验的平均值。星号(*)表示实验组与对照组的差异有统计学意义。(t检验，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001）。（b）转录因子，花色苷途径基因和花色苷之间的相关性网络。（c）通过半定量RT-PCR确定阳性转基因品系（d）恢复过表达bHLH3的拟南芥tt8突变体的种子色素沉着。WT，野生型；tt8-4，拟南芥tt8突变体；bHLH3 / tt8，bHLH3-转基因植物的T2种子。比例尺为1 mm。（e）不同桑葚果实的表型，F2-R，F2-P和F2-W是源自LJ109和ZZB的F2群体。（f）ANS，MYBA，bHLH3 和MYB4在不同桑葚品种成熟果实中的qRT-PCR结果。
7. MYB4被bHLH3激活，抑制花青素和原花青素的生物合成
一个在其c端带有C1和C2抑制基序的R2R3-MYB抑制因子，名为MYB4，存在于连接网络中，并与bHLH3的表达呈正相关。MYB4的转录水平与ANS和bHLH3的转录水平在果实成熟的不同阶段以及白色和富含色素的果实中高度相关(图3b,6f)。与其作为转录抑制因子的作用一致，MYB4定位于洋葱细胞的细胞核。在Y2H、BiFC和split荧光素酶互补检测中，MYB4与bHLH3、GL3和TTG1相互作用。Y3H试验中，MYB4能够与bHLH和TTG1形成三元配合物(图4a-d)。这些结果表明，MYB4是桑葚中平衡类黄酮积累的负反馈调节机制的一员。
为了确定MYB4是否抑制类黄酮合成，我们在烟叶中进行了瞬时表达测定，发现用MYBA，bHLH3和空载体转化烟草叶片一周后导致红色色素沉着，而当MYBA和bHLH3与MYB4共表达时未发生色素沉着（图7A）。双荧光素酶报告基因检测同样发现MYBA，bHLH3和空载体的浸润激活了ANS启动子，而用MYB4取代空载体导致与ANS启动子结合活性显着降低（图7b）。为了测试MYB4是否也会对PA积累产生负面影响，我们在拟南芥中外源表达了CaMV 35S启动子驱动的MYB4。与预期的一样，野生型拟南芥在种皮中积累了大量的PAs，使种皮呈棕色。相反，过表达MYB4的转基因植物具有淡黄色种皮的种子，该种皮不能被DMACA染色，表明PA含量非常低（图7c，d）。在双荧光素酶测定中，向TT2L2 / GL3复合物中添加MYB4会降低LAR启动子活性（图7e）。
为了进一步验证bHLH3是否参与MYB4表达的激活，我们进行了双荧光素酶报告基因检测，发现MYB和bHLH3的结合激活了MYB4的启动子，此外，TT2L1和TT2L2与bHLH3或GL3相互作用时，均激活MYB4的启动子（图7f）。为了验证该结果，我们获得了由MYB4启动子驱动表达GUS的转基因烟草植株。结果发现，与空载或单一成分的烟叶相比，瞬时表达二元复合体的烟叶，如MYBA / bHLH3，TT2L1 / bHLH3，TT2L1 / GL3，TT2L2 / bHLH3或TT2L2 / GL3，具有较高的GUS活性（图7g–j）。
图7 MYB4参与了一种负反馈机制来平衡花青素和PAs的积累
（a）烟草叶片中MYBA/bHLH3和MYBA/bHLH3/MYB4 的瞬时表达。（b）双荧光素酶报告基因检测结果表明，MYB4能抑制ANS启动子。这些数据代表四个实验的平均值。（c）通过半定量RT-PCR确定阳性转基因品系，AtActin作为内标。（d）野生型拟南芥和过表达MYB4的转基因拟南芥植物的DMACA染色（下排）和未染色（上排）种子，WT：野生型，OE-MYB4：MYB4转基因植物种子，比例尺为1 mm。（e）双荧光素酶报告基因检测表明，MYB4能抑制LAR启动子的活性。这些数据代表四个实验的平均值。（f）MYB激活因子与不同bHLH辅因子对MYB4启动子激活的影响。SK，空向量。这些数据代表四个实验的平均值。（g）利用转基因烟草瞬时表达系统验证MYB/bHLH二元复合物对MYB4启动子的激活作用。通过MYB4启动子驱动表达GUS基因的转基因烟草。GUS以10:1的比例在经候选转录因子和海肾荧光素酶瞬时转化的转基因烟草叶片中表达。比例尺为1 mm。（h）候选TFs和海肾荧光素酶瞬时转化烟草叶片中GUS活性的测定。（i）瞬时转化候选TFs和海肾荧光素酶的转基因烟草叶片中海肾荧光素酶活性的测定。（j）通过花青素和PA激活复合物激活MYB4启动子。以海肾荧光素酶信号作为GUS活性正常化的内参。这些数据代表了三个实验的平均值。星号(*)表示实验组与对照组的差异有统计学意义。(t检验，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001）。使用单因素方差分析进行处理间的显著性分析(P <0.05)。
讨论
1.bHLH3是调节桑葚类黄酮途径不可或缺的物质
MYB-bHLH-WD40转录复合物是调节类黄酮途径的高度保守模型，激活因子型MYBs主要决定靶基因。在本研究中，我们鉴定出5个R2R3-MYBs，2个来自IIIf亚群的bHLHs和1个参与调节桑葚类黄酮合成的TTG1蛋白。我们的研究结果表明，除MYBF和TT2L3外，其他MYB因子MYBA、TT2L1和TT2L2与bHLH3或GL3相互作用，并与TTG1形成MBW复合物。尽管不同复合物之间的相互作用强度相同，但特异性靶基因仅被特异性MYB和bHLH蛋白形成的复合物激活，例如，虽然MYBA与bHLH3或GL3相互作用形成MBW复合物，但只有MYBA与bHLH3结合激活花青素生物合成基因(CYP75B1、ANS和UFGT)的表达来控制花青素的生物合成。然而MYBA只作用于bHLH3，TT2L1和TT2L2蛋白与bHLH3或GL3相互作用激活了结构基因的表达。例如TT2L1/GL3和TT2L2/GL3复合物激活LAR的表达，而TT2L1/bHLH3激活CHS2、CYP75B1、F3H的启动子。同样，TT2L2/bHLH3激活DFR和CHI的启动子。我们发现烟草中过表达TT2L1或TT2L2导致PA含量增加，这表明这些基因在PA生物合成中的调控作用；相反，MYBF可以独自激活FLS1、FLS3和UFGT，并调节黄酮醇的生物合成。
多项研究表明，不同植物品种间相同组织中花青素水平的差异主要归因于MBW络合物中的MYB成分，例如，PavMYB10.1决定甜樱桃果实的果皮颜色，而其截短等位基因PavMYB10.1 1b降低了‘Rainier’品种花青素的生物合成。在马铃薯中，Stan2对块茎皮中紫色和红色花青素的生物合成是必不可少的。该基因在紫色和红色后代的块茎表皮中表达，而在白色的块茎中没有表达，这意味着它的表达决定了块茎表皮的颜色。在本研究中，MYBA和bHLH3的基因产物在紫色桑葚和淡色桑葚中没有差异，在淡色桑葚的等位基因中我们没有发现任何剪接位点的改变或过早的停止密码子。虽然MYBA和bHLH3参与了花青素合成的调控，但只有bHLH3转录本水平与紫色和浅色果实中早期(EBG)和晚期(LBG)花青素合成基因的水平相关；此外，在LJ109和ZZB衍生的F2群体中，bHLH3的表达量与ANS的表达量和果实着色程度高度相关，而MYBA的转录水平在F2群体中没有差异。由于bHLH3是MYBA、TT2L1和TT2L2的共享伙伴，它可以形成三种MBW复合物来控制桑葚类黄酮的生物合成。这一发现表明bHLH3是类黄酮生物合成调控网络的主干；然而，色素丰富果实和浅色果实之间bHLH3转录水平差异的原因尚不清楚。
顺式和反式作用元件被认为是决定基因表达的主要因素。在CS、BYW和HG2的bHLH3启动子中，除5 -UTR Py-rich stretch元件外，未发现与果实着色相关的显著SNP位点，5 -UTR Py-rich stretch与高转录相关。在着色丰富的桑葚中，这个stretch元件最长，在浅色果实中最短，而来自CS、HG2和BYW的bHLH3启动子也表现出相同的转录活性；相反，在富含色素和浅色水果中bHLH3表达的差异可能是反式作用元素造成的。在基于花青素化合物和转录本构建的连接网络中，有36个转录因子与bHLH3的表达高度相关(图6b)，这些候选转录因子可能与bHLH3具有上下游调控关系，例如，L484_026215、L484_003860、L484_017595分别是拟南芥GL2、TTG2和TRY的同源基因，它们的转录水平与bHLH3在连接网络中的表达呈正相关。在拟南芥中，AtGL2的表达是由MBW激活因子复合物激活的，然后，AtGL2调节粘液合成和细胞命运的决定。此外，AtGL2通过直接抑制一些MBW成分调控子(如AtTT8、AtPAP1、AtPAP2、AtMYB113、AtMYB114)的转录，对花青素合成具有负调控作用。我们推测含有bHLH3的MBW复合物也调控桑葚中的L484_026215，进而，L484_026215的产物抑制了MBW复合物中MYB和bHLH的表达，从而限制了花青素的生物合成。同样，MBW复合物(AtTT2 AtTT8 AtTTG1)可以直接激活AtTTG2。在调控毛状体发育方面，AtTTG2调控R3 MYB基因的毛状体模式依赖于MBW复合物。在矮牵牛花中，拟南芥TTG2的同源基因PH3被一个MBW复合物(PH4 AN1 AN11)激活；然后，PH3与MBW复合体结合，调控PH5和PH1(编码p-ATP酶跨膜转运体)的转录，最终通过液泡酸化修饰花的颜色。结果表明，L484_026215、L484_003860和L484_017595是bHLH3的下游调控基因：与MYB4类似，L484_026215的产物具有平衡花青素积累的负反馈调节作用；L484_017595由L484_003860调节；L484_003860被含有bHLH3的MBW复合物激活，通过液泡酸化参与果实颜色的修饰。连接网络中的一些转录因子可能参与bHLH3的异常表达，这将是未来研究的重点。综上所述，这些发现表明MYBA的活性功能依赖于bHLH3，bHLH3在调节桑葚类黄酮的生物合成中起着重要作用。
2.MYB4在桑葚中发挥负反馈调节作用，平衡花青素和PA的积累
3.bHLH3的异常表达破坏了体内平衡调节网络，导致桑葚果实色素组成的差异
图8 提出了桑葚品种间果实颜色差异的模型
(a)构建桑葚类黄酮稳态激活和反馈调节机制网络。MYBA-bHLH3-TTG1调控花青素的生物合成，TT2L1/TT2L2-bHLH3/GL3-TTG1调控PAs的生物合成。bHLH3是调控网络的关键组成部分，参与大多数结构基因的调控。这些MBW复合物激活MYB4的表达，然后MYB4竞争性地抑制花青素和PAs的生物合成，以防止植物产生过量的花青素和PAs。MYBF调节黄酮醇生物合成无需任何伴侣。一种未知的激活因子可能决定bHLH3的表达。(b)通过bHLH3表达的差异改变桑葚的色素沉着。在HG2(紫色果实)中，类黄酮的合成受到调控网络中调控因子的有序控制。BYW(白色果实)和c(黄色果实)，异常表达bHLH3扰乱了这种动态平衡机制：MYB4 bHLH3不能有效地激活，导致水果色素沉着过程中的反馈调节机制失效，MBW复合物依赖bHLH3不能有效激活他们的目标基因，从而减少类黄酮积累。DFR表达的减少导致碳通量向上游分支转移，导致CS和BYW中黄酮醇的比例高于HG2。由于在CS中MYBF的低表达和FNS的高表达，花青素和黄酮醇通路的阻塞将碳流转移到上游黄酮通路，导致CS中黄酮含量最高。
结论
花青素含量高的桑葚因其口感好、色泽鲜艳、营养价值高而受到消费者的青睐。在本研究中，我们对不同颜色的桑葚果实进行了代谢组学、转录组学，以及体内外验证，最终确定了bHLH3在桑葚果实色泽调控中的重要作用。体外和体内实验表明，MYBA-bHLH3-TTG1调控花青素的生物合成，而TT2L1和TT2L2与bHLH3或GL3协同作用，与TTG1形成MYB-bHLH-WD40 (MBW)复合物，调控原花青素(PA)的合成。功能和表达分析表明bHLH3是控制桑葚着色的调控网络的关键调控因子，MYB4被MBW复合物激活，参与调控网络的负反馈控制，平衡花青素和原花青素的积累。研究还表明，bHLH3和MYB4在动态平衡调控网络中的相互作用确保了桑葚体内积累理想的黄酮类化合物，并且该网络在富含色素的桑葚中是稳定的；然而，bHLH3的异常表达破坏了网络的平衡，改变了淡色果实中类黄酮代谢通量，导致不同颜色桑葚(红、黄、白)中花青素、黄酮和黄酮醇的水平和比例不同。本研究结果揭示了桑葚果实颜色多样性的分子基础。
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