科研 | Adv. Sci.：如何识别在经皮冠状动脉介入治疗后，能预测患者复发性心绞痛风险的代谢特征？
编译：微科盟红烧大肥鸥，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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论文ID
原名：Machine Learning Identifies Metabolic Signatures that Predict the Risk of Recurrent Angina in Remitted Patients after Percutaneous Coronary Intervention: A Multicenter Prospective Cohort Study译名：机器学习识别在经皮冠状动脉干预后预测患者复发性心绞痛风险的代谢特征：一项多中心前瞻性队列研究
期刊：Advanced science
IF：15.84发表时间：2021.03通讯作者：柳景华，李克峰
通讯作者单位：首都医科大学附属北京安贞医院，加州大学圣地亚哥分校
实验设计
实验结果
1. 患者特征
我们首先进行了一项初步研究，计算最小样本量以获得真实的统计差异。功效分析表明，我们对140名受试者的真实判别特征有80%的检测能力（图1A）。本研究包括三个独立的队列，共1655名患者。在发现队列820例稳定型心绞痛患者中，有797例通过PCI和OMT缓解了心绞痛。我们在患者出院前收集血浆样本并对缓解的患者进行了心绞痛复发的随访，有44例患者丢失随访记录。在9个月中，210名患者（28.0%）复发心绞痛，540名无心绞痛（图1B）。缓解后的心绞痛复发患者和无心绞痛患者的基线特征相似（表1），这些基线变量仅具有轻度或中度的效应大小。在另外的发现队列评估的832例患者中，有20例PCI和OMT患者并未有缓解心绞痛现象，还有36例患者丢失随访记录。在9个月时，有198名患者发展为RA（25.5%），其中577例无心绞痛（图1C）。外部验证队列是从另一个医疗中心收集的，共有130名患者参加了分析。随访结束时，有40（30.8%）例患者出现心绞痛复发，其中90例患者无心绞痛（图1D）。
A）通过功效分析估计样本大小，以确保检测到的真实差异，FDR控制在0.05。B）发现队列。PCI后，对稳定型心绞痛患者进行了9个月的前瞻性随访，以观察心绞痛的复发情况。总共750名患者被用于代谢组学分析。C）来自同一家医院的另一个独立发现队列（n = 775）。D）来自另一家医院的外部验证队列（n = 130）。E）靶向人类血浆中主要化学类别的总共606种代谢物。
表1 发现队列中患者的特征（n = 750）
2. 未来心绞痛复发缓解期患者血浆独特代谢特征
为了发现和内部验证研究，我们对606种代谢物进行了代谢组学分析，涵盖了人类血浆中的主要化学类别（图1E）。在整个分析过程中，通过重复质控（QC）样品测量，我们在所有重复性极佳的血浆样品中共检测到407种代谢物（日间变异中位数为11.5%）。
对发现队列中PCI术后心绞痛复发时间的Kaplan-Meier分析如图2A所示。登记后复发的中位时间为7个月（智商：5~8月）。多元偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示，在发现队列中，未来RA缓解期患者和无心绞痛患者的血浆代谢谱有明显的分离（图2B）。同样，在额外的发现队列中，未来RA缓解期患者的代谢特征仍然可以通过多变量分析与无心绞痛患者区分开来。PLSDA模型的可靠性通过Q2值均大于0.4的留一法交叉验证（LOOCV）进行验证。图2C显示了发现队列中区分心绞痛和无心绞痛的代谢物。尽管明显不同的代谢物较少，但代谢组学分析揭示了额外发现的队列中类似的心绞痛复发变化现象。通路分析显示，未来心绞痛复发的缓解期患者的代谢特征主要是脂质代谢的改变（图2D）。受影响最大的脂质途径是鞘脂、磷脂、脂肪酸氧化和二十烷类化合物。图2E显示了受干扰的关键代谢途径之间的相互联系。单变量分析进一步证实了从多变量分析中获得的发现，如火山图所示（图2F）。
图2 未来心绞痛复发缓解期患者的代谢和生化途径异常
A）在发现队列中，PCI后发生心绞痛复发的时间的Kaplan-Meier分析。在PCI后的9个月中，每30天评估一次患者的心绞痛复发情况。n = 210（缓解的RA患者），n= 540（无心绞痛患者）。虚线为95%CI。B）PLS‐DA显示，在PCI后9个月内，缓解后的心绞痛复发患者血浆中的代谢谱与发现队列中无心绞痛的患者明确分离。C）在发现队列中按VIP分数排名的前25名可区分的代谢产物。VIP分数≥1.2被认为具有统计学意义。D）对于发现队列，与无心绞痛的患者相比，缓解的RA中生化途径的气泡图。E）发现队列中未来心绞痛复发的缓解患者的详细代谢途径发生了改变。红色和向上箭头表示代谢物水平增加。蓝色和向下箭头指示代谢物水平的降低。F）火山图显示了发现队列中缓解型心绞痛复发患者和无心绞痛患者之间显着差异代谢物的单变量分析。进行差异倍数（FC）和多个t检验。FC（缓解的RA/无心绞痛）>1.2。FDR调整后的P值<0.05。缓解RA的n = 210，无心绞痛的n = 540。缩写：PCI：经皮冠状动脉介入治疗；缓解型RA：缓解型患者，可复发性心绞痛；CI：置信区间；PLS-DA：偏最小二乘判别分析；VIP：变量对模型的重要性；FDR：错误发现率。
3. 在两个大型独立发现队列中早期预测未来心绞痛复发的新的多代谢产物模型的建立
由于以前很难建立可在整个队列中复制的生物标志物组，因此在本研究中，我们对两个大型独立发现队列进行了广谱代谢组学分析，以最大程度地降低队列的特定影响。代谢组学数据是高维的，而且经常是相关的。机器学习可以降低代谢数据集的维数，提高风险预测的准确性。我们结合了三种机器学习方法，包括PLS-DA、随机森林（RF）和Cox回归进行特征约简和选择。这种集成方法的优点之一是获得比单独从任何成分学习算法获得的更好的预测性能。
由于大量的特征来自代谢数据，我们首先使用PLS-DA对两个发现队列进行特征约简（图3A）。在发现队列111种有区别的代谢物（心绞痛组和非心绞痛组）中，有62种（55.9%）在另外的独立发现队列中重复出现（图3B）。接下来，我们通过控制基线变量，使用多变量Cox回归评估了PLS-DA确定的不同代谢物与未来心绞痛复发之间的关系。在两个队列的62种共有差异代谢物中，53种与心绞痛复发显著相关。与未来心绞痛复发相关的前20个重要代谢预测因子如图3C所示。RF是另一种常用的机器学习方法，用于基于组学的生物标记物发现，因为它对高维数据具有弹性，对噪声不敏感，并且对过拟合不敏感。然后，我们使用RF来确定在发现和其他发现队列中，哪些变量对预测结果有更大的决定性影响。代谢物对RA缓解期患者和无心绞痛患者的重要性通过图3D的平均降低准确度（MDA）评分进行排序。本研究选择MDA得分最高的60个代谢物，并在两个大型发现队列之间进行比较进而找出重复的代谢物。两组中有25种代谢物符合所有三种机器学习方法的分界点标准（PLS-DA中的VIP≥1.2，Cox回归P <0.05，且排名前60的MDA得分）。
图3 开发了一种新颖的多代谢物模型，用于在发现和其他独立复制队列中使用多种机器学习算法来预测心绞痛的未来复发
A）在两个独立的队列中使用多种机器学习算法的组合进行特征选择的流程图。“AND”表示两个集合的交集。B）发现（n = 750）与其他独立发现队列（n= 775）。每个队列中的差异代谢产物（RA缓解与无心绞痛）定义为PLS‐DA所确定的VIP评分≥1.2。C）Cox回归分析显示发现队列中与未来心绞痛复发显着相关的前20种代谢物。HR是log2转换值的每1 SD的增量。对基线年龄、BMI、高血压状态、hsCRPP和LDL进行多变量分析调整。D）在发现队列中，前15种代谢物按其对RF中心绞痛复发的分类准确性（MDA分数）的贡献进行排序。E）与未来心绞痛复发相关的丰富代谢途径。每个节点代表一个代谢组，其颜色基于其P值。进行超几何测试以评估特定代谢物组在给定文库中的表达是否超出了预期。双尾P <0.05和FDR≤0.2被认为具有统计学意义。F）六个选定的代谢预测因子及其生化途径，P内部验证队列中的Mann–Whitney U测试值，PLS‐DA VIP分数，MDA分数和LASSO频率。G）在另外的发现队列中，选定的代谢预测因子与心绞痛复发的未来风险的关联。进行多变量Cox回归，并针对基线年龄、BMI、高血压状态、，hsCRP和LDL调整模型。HR是log2转换值的每1 SD增量。H）由发现队列中的代谢预测因子，hsCRP和LDL生成的ROC曲线。I）排列检验（n= 1000次）用于确认ROC分析在发现队列中由代谢特征产生的预测模型的鲁棒性。J）由代谢特征、hsCRP和LDL生成的ROC曲线，用于预测其他发现队列中的未来心绞痛复发。K）内部验证队列中由代谢特征生成的预测模型的鲁棒性已通过置换测试得到证实。其他特性在表2中列出。缩写：缓解型RA：缓解型患有复发性心绞痛的患者。VIP：预测差异；PLS-DA：偏最小二乘判别分析；SD：标准偏差；MDA：平均降低精度；BMI：体重指数；hsCRP：高敏感性C反应蛋白；LDL：低密度脂蛋白；ROC：观测者操作特性曲线；CI：置信区间。PI：磷脂酰肌醇；SM：鞘磷脂；LysoPC：溶血磷脂酰胆碱；MCC：马修斯相关系数。
生物标志物的发现不仅需要优化有关生物学相关的生物标志物有效性，还需要预测模型中使用的代谢物数量。鉴于同一生化途径中的代谢物在区分RA患者与无心绞痛的受试者中可能发挥相似的作用，因此我们进行了富集分析，以鉴定通过整体机器学习方法鉴定的25种代谢物的代谢途径。如图3D所示，四个生化途径在P<0.05和错误发现率（FDR）≤0.2时富集，包括脂肪酸氧化（酰基肉碱），鞘脂，磷脂和类花生酸代谢（图3E）。使用向前选择和从不同途径向后消除代谢物的方法，我们发现，一旦选择了一组核心的六种代谢产物，添加一种或几种分析物对分类器的整体质量几乎没有影响（图3F）。其中12-HETE，神经酰胺（d18:1/18:2 OH）和L-棕榈酰肉碱与心绞痛复发的风险增加呈正相关，而LysoPC（18:0），PI（36:2）和在其他发现队列中，SM（d18:1/16:2）与未来RA风险增加呈负相关（图3G）。
通过受试者工作特征曲线（ROC）分析评估了已开发的多代谢物模型对心绞痛复发的预测性能。与RA风险显着相关的常规临床参数hsCRP和低密度脂蛋白（LDL）也用于预测分析，我们得到ROC曲线下面积（AUROC）为0.99（95%CI：0.95-1.0），远高于hsCRP（AUC为0.66、95%CI：0.63-0.69）和LDL（发现队列中的AUROC为0.65，95%CI：0.61-0.68）（图3H）。我们通过随机排列检验进一步验证了代谢生物标志物的预测准确性，P值<0.001（图3I），发现队列中的准确性，敏感性、特异性、准确性、F1得分和Matthews相关系数（MCC）分别为97.6%（95%CI：96.2–98.6%），98.6%（95%CI：95.9-99.7%），分别为97.2%（95%CI：95.5-98.4%），0.93、0.96和0.94（表2）。
同样，在其他发现队列中，代谢特征组可以可靠地提前预测心绞痛的复发，其AUC为0.91（95%CI：0.87-0.94），优于传统的临床参数hsCRP和LDL（图3J，K）。准确性、特异性、准确性、F1得分和MCC始终超过90%或高于0.8（表2）
表2 多代谢物模型在预测PCI术后心绞痛复发中的应用
4. 预测心绞痛复发的多代谢产物模型的外部验证
接下来，我们使用来自不同医疗中心的队列对开发的模型进行了另一次独立验证。与其他两个队列相似，加入外部验证队列后心绞痛复发的中位时间为7个月（IQR：5-8个月）（图4A）。用LC-MS/MS对生物体液进行定量分析是预防和诊断护理的金标准技术。为了验证发现和其他发现队列中代谢组学的结果，我们开发了一种新的稳定同位素稀释LC-MS/MS方法来定量外部验证队列血浆中选定的代谢预测因子，该方法比代谢组学在定量水平上更准确可靠，具有更大的临床实用价值。
在整个队列中，代谢特征组的含量变化是一致的，其中LysoPC（18:0），PI（36:2），SM（d18:1/16:2）的水平明显较低，而与无心绞痛的患者相比，未来RA缓解的患者血浆中的12-HETE、神经酰胺（d18:1/18:2 OH）和L-棕榈酰肉碱显著升高（所有P值均<0.05）（图4B–F）。当将受试者分为前50％和后50％时，前50％的SM（d18:1/16:2）缓解患者复发的速度要慢得多（8±1 vs 4±1个月，HR = 0.82 ，95%CI:0.75–0.86，P = 0.031）（图4G）。PI（36:2）水平升高（HR = 0.73，95%CI:0.66-0.77，P= 0.011）和LysoPC（18:0）（HR = 0.69，95%CI:0.62-0.74，P <0.01）可降低复发风险（图 4H，I）。相反，神经酰胺（d18:1/18:2 OH）（> 0.57 µM，HR:1.94，95%CI:1.61-2.23，P <0.01）中L-棕榈酰肉碱（> 0.28 µM，HR = 1.72，95%CI:1.42-2.11，P = 0.028）和12-HETE（> 0.013 µM，HR = 2.91，95%CI:2.43-3.45，P <0.001）水平较高的患者更有可能在PCI术后9个月内出现心绞痛复发（图4J-L）。最后，我们使用多元logistic回归在外部验证队列中建立了多代谢物模型。选择的6种生物标记的系数为-2.269（12-HETE），-1.536（L-棕榈酰肉碱），-0.961 [神经酰胺（d18:1/18:2 OH）]，1.508 [LysoPC（18:0）]，0.836 [SM（d18:1/16:2）]和0.787 [（PI 36:2）]。此外，ROC分析表明，6-代谢物预测模型在外部验证队列中表现良好，AUC为0.94（95%CI:0.82–0.99），远高于hsCRP 0.72（95%CI:0.69–900）。0.76）和LDL0.67（95%CI:0.63-0.71）（图4M，N）。准确性、敏感性、特异性，准确性，F1得分和MCC分别为89.2%（95%CI:82.6–93.9%），87.5%（95%CI:73.2–95.8%），90.1%（95%CI:81.9–9）在外部验证队列中，分别为95.3%，0.8、0.83和0.76（表2）。A–F）使用稳定同位素稀释LC-MS/MS方法对六种代谢预测因子进行定量分析。n=40（缓解的RA患者），n= 90（无心绞痛）。在每个小提琴图中，红线代表中位数，绿线是两条四分位数线（75%和25%）。进行了Mann-Whitney U检验以比较组间差异。G-L）PCI后9个月内代谢预测因子与未来心绞痛复发之间关联的Cox回归分析。HR是每1SD的log2转换值。调整模型的基线年龄、BMI、高血压状态、hsCRP和LDL。M）ROC曲线分析，以评估在外部验证队列中由代谢预测因子，hsCRP和LDL生成的预测模型的性能。N）排列检验（n=1000次）用于确认ROC分析对于代谢预测因子的鲁棒性。其他特性在表2中列出。缩写：PCI：经皮冠状动脉介入治疗；LC-MS/MS：液相色谱-串联质谱联用；缓解的RA：缓解的患有复发性心绞痛的患者；HR：危险比；BMI：体重指数；hsCRP：高敏感性C反应蛋白；LDL：低密度脂蛋白；ROC：观测者操作特性曲线；MCC：马修斯相关系数。
讨论
我们的代谢组学分析显示，在有未来心绞痛复发的缓解患者血浆中存在潜在的代谢特征，从而使他们与无心绞痛的对照患者区分开来。由于在缓解期间收集了血浆样品，这种差异在临床上是不明显的。我们发现的代谢异常模式反映了跨脂质膜和线粒体联系的化学通讯改变。脂质异常构成与RA相关的代谢特征的最大比例。更令人惊讶的是，代谢组学分析能够在三个前瞻性队列中揭示潜在的心绞痛复发风险的潜在特征，准确率超过89%。我们的研究通过允许稳定型心绞痛患者根据冠状动脉血运重建后的复发风险和待测试的新预防方法进行分层，可能对临床实践产生重大影响。据我们所知，该研究是第一个鉴定可预测未来心绞痛复发的代谢特征的研究。
使用传统的“三角”方法进行生物标志物发现研究的一个普遍挑战是特定于队列的效应，这尤其与多中心研究有关。在这项研究中，我们使用了改进的“矩形”策略，通过该策略，对两个大型独立队列进行了广谱代谢组学分析，然后通过机器学习算法一起分析这两个队列。机器学习使我们能够减少数据集的维数并提高风险预测模型的准确性。我们结合多种基于机器学习的方法，将多种机器学习方法用于特征约简和选择。基于集成的方法是根据如下想法：即群体决策可以利用各个算法的优势，克服它们的弱点，并获得更可靠的结果。使用稳定的同位素稀释法进一步验证了开发的多代谢物模型来自另一个中心的第三个队列中的LC-MS/MS方法。我们注意到，与代谢组学评估相比，此类靶向平台在定量上更合理，具有更大的临床实用性。总体而言，我们的策略可以辨别与RA相关的变化，这些变化反映了血浆代谢组的一部分与其他队列的特异性效应不同(包括大部分量化的血浆代谢组)
本研究发现可调节心绞痛复发风险的预后代谢物来自几种脂质途径，包括类花生酸（HETE），鞘脂，磷脂和酰基肉碱。高12-HETE是缓解患者未来心绞痛复发的最可预测风险因素。HETE是由20个碳的多不饱和脂肪酸（如花生四烯酸（C20:4））在非酶促脂质过氧化或脂氧合酶（LOXs）胁迫下形成的一类脂环素。这些源自花生四烯酸的HETE参与了多种炎症性病理过程，即涉及脂质氧化的早期机制（这些代谢物可能是原因或结果的一部分）可能有助于事件发生前的RA病因。
鞘脂类（鞘磷脂和神经酰胺）在心血管疾病中的重要性已被近期几项研究所评估。除了在我们的研究中发现与心绞痛复发的显着相关性外，神经酰胺水平升高被报道是CAD的生物标志物，也是突发性CVD、心力衰竭、房颤、和CVD死亡的风险预测因子。此外，这些代谢物既具有质膜结构的功能，又具有跨化学反应的信号传递功能细胞之间的脂质膜。在生长条件下，神经酰胺通过鞘磷脂合酶在高尔基体中转化为鞘磷脂，然后在不同的囊泡中转运至质膜。相反，应激刺激通过鞘磷脂酶促进鞘磷脂的分解，并且所产生的神经酰胺也参与其中。在可能影响心绞痛复发的多种生物学过程中，包括炎症，内皮功能障碍和凋亡。此外，我们的研究表明2'-羟基（2'-OH）神经酰胺可能是更可靠的预测因子而不是神经酰胺本身引起的心绞痛复发。过氧化物酶体脂肪酸2-羟化酶（FA2H）催化鞘糖脂酰胺酰基链的脂肪酸前体的2'-羟基化反应。[32] 2'-OH神经酰胺在心血管疾病中被广泛忽略，并且进一步有必要进行研究以研究RA中神经酰胺羟化的生物学机制。
酰基肉碱是肉碱的脂肪酸衍生物，其介导将长链和中链脂肪酸从细胞质导入线粒体以进行β氧化。这些代谢物在心肌和骨骼肌中特别丰富，它们优先使用脂肪酸来产生能量。酰基肉碱可通过肉碱-酰基肉碱的转移酶离开线粒体并进入血流。当线粒体脂肪酸氧化受损时，几种酰基肉碱会在血液中积聚并升高。在这项研究中，在缓解的RA患者中血浆酰基肉碱含量增加。我们的观察表明，即使在缓解的患者中，线粒体功能障碍也可能持续存在并在心绞痛复发中起作用。
我们的研究为缓解期RA患者的风险分层提供了一种新的模型。如果类花生酸，磷脂，鞘脂和酰基肉碱同时存在，则超过80%的复发性代谢风险可能需要干预。最近的研究表明，某些抗抑郁药（例如氟西汀）可以抑制神经鞘磷脂向神经酰胺与压力相关的转化，降低HETE并恢复正常的酰基肉碱水平。此外，以前的荟萃分析表明，抗抑郁药治疗可能会改善CVD预后。新的临床试验旨在测试某些抗抑郁药在降低PCI后降低心绞痛复发风险方面的潜在益处，可能是应用这项研究结果的下一步。
我们的研究有几个主要优点。首先，这是一项大型，多中心，前瞻性研究，具有广泛的临床信息，中途退出率低；其次，我们进行了“矩形”策略，然后集成了几种先进的机器学习算法，以生成可靠且可重现的预测模型；第三，从几种不同的生化途径中选择的代谢预测因子可以提供更准确和全面的疾病状态读数。因此，我们的方法限制了对虚假或特定群体关联的识别。
本研究有一些局限性值得讨论。RA的潜在原因是复杂的。虽然我们已经仔细调整了潜在的协变量，但不能排除残留干扰的可能性。此外，我们样本人群的年龄和种族同质性可能会限制我们的研究结果推广到其他人群。为了证实我们的结果，有必要在更多样化的年龄和人口群体中进行额外的验证。
结论
总而言之，基于三个独立队列的可重复性研究结果，本研究确定了PCI后以脂质生化途径（包括鞘脂，磷脂，类花生酸和脂肪酸氧化）改变为主的缓解患者的RA特异性异常。我们利用这种独特的代谢特征开发并验证了一种新颖的多代谢物预测模型，该模型可以以超过89%的准确性前瞻性地确定心绞痛的复发风险。在临床医生的医疗机构中纳入这些风险生物标志物有可能极大地提高识别高危患者的能力，使早期干预成为可能，并有可能减少PCI术后心绞痛的复发。
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