科研 | NAT COMMUN: 帕金森病患者的脂质失调背后的机制是什么？

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编译：微科盟孙元芳，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

帕金森病(PD)是一种神经系统退行性疾病，其特征是不同神经元群的退化，包括黑质多巴胺能神经元。本研究中我们使用代谢组学分析方法来观察识别PD患者皮脂(一种无创可用的生物液体)中的脂质变化。我们使用液相色谱质谱仪(LC-MS)分析了274个样本(80个未经药物治疗的PD患者, 138个药物治疗PD患者和56个匹配良好的对照受试者)，并检测出可以预测PD表型的代谢物。通路富集分析显示PD患者体内与肉碱穿梭、鞘脂代谢、花生四烯酸代谢和脂肪酸生物合成相关的脂代谢发生改变。这项研究表明皮脂可以用来识别PD的潜在生物标志物。

论文ID

原名：Metabolomics of sebum reveals lipid dysregulation in Parkinson’s disease译名：皮脂代谢组学揭示帕金森病患者的脂质失调
期刊：Nature Communications
IF：12.121发表时间：2021.03通讯作者：Perdita Barran
通讯作者单位：曼彻斯特大学

实验设计

实验结果

1. 患者元数据分析

研究人群包括274名参与者，包括138名药物治疗的PD患者，80名未经药物治疗的PD患者和56名对照对象，表1概述了患者的人口学特征。双侧Mann-Whitney U检验显示年龄在对照组和PD组(无药物治疗组和药物治疗组)之间有显著差异(p<0.05)，但这些组之间的BMI在统计学上没有显著差异。两组PD患者中男性参与者均较多(男/女>1.5)，而对照组中女性参与者比例较高(男/女<1)。人们已经认识到男性人口中帕金森氏症的发病率和流行率更高，而且有研究表明男性帕金森氏症病例的数量增加了1.4-1.5倍，尽管原因尚不清楚。我们对吸烟(是/否)或饮酒(是/否)的参与者数量进行类似的比较，发现无药物治疗PD组和对照组之间没有显著差异，p值分别为0.837和0.192。然而与药物治疗PD患者相比，对照组饮酒的参与者数量高出2.5倍。药物治疗PD组中没有吸烟者，对照组中有7%的吸烟者，我们认为两组间存在显著性差异(Fisher’s精确检验的p值0.006)。在PD和对照队列中发现这些元数据参数的显著差异使我们了解了它们对分类准确性的影响，这些影响在以下结果部分中进行了描述。

表1 参与者的人口统计元数据

2. 数据驱动的PD预测

我们利用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)分析了不同表型代谢组之间的差异。建立了两个PLS-DA模型，每个模型都使用两类输入：(1)无药物治疗PD组与对照组，(2)药物治疗PD组与对照组。众所周知，分类组内的数字不平衡可能会使预测精度偏向多数类别，为了克服这一点，本研究应用了合成少数过抽样技术(SMOTE)。我们采用带替换的Bootstrap重采样方法建立和验证PLS-DA模型(n=250)。图1报告了每个PLS-DA模型的分类敏感度和特异度，以及观察到的分布和零分布(来自排列测试)。

为了评估性别是否影响分类的准确性，我们分别为每个性别建立了两个PLS-DA模型，分别是无药物治疗PD组与对照组和药物治疗PD组与对照组。如果解释疾病和对照之间差异的化合物是与性别相关的，我们可以预期性别的敏感度和特异值是一致的，而且显著性更高，但我们发现这并不是真的，因为联合的性别模型具有更大输入群体的统计模型具有更高的能力，所以它被用于随后的分析（图1）。PLS-DA也被用来确定地理位置或临床医生采样之间的差异是否会影响使用独立对照队列的分类，样本(n=40)来自位于英国北部(n=2)和南部(n=2)的四个招募诊所，控制了混杂因素，使年龄和BMI在组间无统计学意义(单因素方差分析，p值>0.05)，男女比例相同。该模型的平均CCR为21%，这表明我们的数据不受招募地点或采集样本的临床医生的影响。

图1 无药物治疗PD组与对照组和药物治疗PD组与对照组的PLS-DA分类模型

a、c，每个模型的分类率包括真阳性(Tp，敏感性)、真阴性(Tn，特异性)、假阳性(FP)和假阴性(Fn)；b、d，每个PLS-DA Bootstrap模型的Null分布(灰条)和观测分布(蓝条)。仅从测试集(来自Bootstraps的n=250)计算正确分类率(CCR)。

3. 选择可分类PD的显著特征代谢物

为了定义在PLS-DA预测模型中对测量变量有影响的特征，我们计算了变量投影重要性(VIP)得分，并对VIP评分>1的变量进行受试者操作特征(ROC)分析(图2)。在无药物治疗PD组分析中达到这一阈值的变量有15个，而药物性帕金森病组中有26个。从单变量ROC曲线分析中获得的每个独立变量的曲线下面积(AUC)和95%置信区间(CI)在附图2中报告。但是个体特征ROC分析的一个限制是没有考虑到特征之间的关系。多变量分析的结果被简化为单变量分析，其中每个单独的特征都被视为唯一的生物标记，占类别之间变异的100％。所以结合评价个体代谢物ROC曲线，实现了基于PLS-DA方法的多变量ROC分析方法(图2a、b)。

我们注意到PLS-DA不能准确区分药物治疗PD组和无药物治疗PD组。以药物帕金森病为“阳性”预测类别的PLS-DA模型的敏感度和特异度分别为59.7%和50.3%。图2a、2b分别报告了无药物治疗PD模型和药物治疗PD的ROC曲线，每种模型分别使用大于1的所有VIP化合物。非药物帕金森病组与对照组和药物帕金森病组与对照组模型的VIP评分检查证实两组帕金森病患者共有10个变量(VIP>1)。本项目为了寻找与帕金森病诊断相关的生物标志物，进一步评估了无药物治疗PD组和药物治疗PD组之间的共同代谢物(VIP>1)。图2c显示了每个共同代谢物的多变量ROC分析，该分析报告了敏感度和特异度随每个模型中包含的变量数量的增加而增加。此外，随着每个模型中变量数量的增加，95%的置信区间范围也随之减小。

我们计算了每个显著变量(VIP>1)的Pearson相关系数，以研究酒精与显著变量之间的关联。补充图3显示所有显著变量与酒精消耗量的增加都无关。为了排除年龄对疾病分类的可能影响，我们将年龄作为建立PLS-DA模型的一个变量（与其他任何测量变量具有相等的权重）。包括年龄和不包括年龄的PLS-DA模型之间的CCR差异可以忽略不计（p<0.5%）。在无药物治疗帕金森病组和药物治疗帕金森病组中，年龄变量的VIP值分别为1.17×10⁻¹¹和2.11×10⁻¹¹。在两个模型的6502个变量中，年龄变量的VIP排名为6492和6498，这表明年龄对无药物治疗帕金森病组和药物治疗帕金森病组的分类没有贡献。

图2 基于多元PLS-DA算法的ROC曲线分析，输入两个潜在变量AUC和95%置信区间(CI)，采用蒙特卡罗交叉验证(MCCV)方法，采用多次重复的分段抽样计算ROC曲线

a，VIP>1的无药物治疗PD组与对照组PLS-DA的ROC曲线分析(n=15个独立的代谢物特征)；b,VIP>1的PD组与对照组PLS-DA组的ROC曲线分析(n=26个独立的代谢物特征)；c，条形图显示使用模型之间的共同VIP(n=10个独立代谢物特征)的无药物治疗PD(紫色)和药物治疗PD(蓝色)的AUC的比较，数据以平均AUC值的形式呈现，误差条表示95%CI范围的最小值和最大值。

4. 与帕金森病诊断相关的代谢物注释

我们遵循代谢组学标准倡议(MSI)指南和国际脂质分类和命名委员会(ILCNC)指南对常见的重要代谢物进行注释(n=10)(表2)。表2A基于五种重要化合物的准确质量和串联质谱碎裂数据的推定注释(MSI级别2)。表2B报告了基于精确质量的数据库匹配结果。五个化合物中的三个化合物是通过LipidMaps数据库和Metlin数据库在质量容差10ppm范围内匹配得到的；然而剩下的的两个化合物没有匹配出结果。神经酰胺、三酰甘油、鞘糖脂和脂肪酰脂类在常见和非常见的VIP化合物中都有推测的注解。神经酰胺、三酰甘油和脂肪酰基类的代谢物在帕金森病患者中表达下调，而神经鞘脂和脂肪酰基代谢物表达上调。图3显示了这些化合物在对照组、无药物治疗PD组和药物治疗PD组中的含量。

表2 无药物治疗PD组和药物治疗PD组之间共有的10种VIP>1的化合物的推定注释

（A）已使用精确的质量和与脂质图数据库（LMSD）和脂质Blast相匹配的MS / MS碎片分配了推定注释；

（B）已使用与脂质图（LMSD和COMP_DB）和METLIN数据库匹配的精确质量测量值来分配推定注释。

图3 对照组(Ctrl，黄色)(n=56个生物独立样本)、无药物治疗PD组(DN，紫色)(n=80个生物独立样本)和药物治疗PD组(Meds，蓝色)队列(n=138个生物独立样本)的8种化合物的含量箱型图

箱形图显示了平均值（正方形），中位数（框内的线）和四分位数（框限制），范围（框外的线）和离群值（菱形）。每个图的y轴对应于强度值的自然对数，每种化合物的测量m / z值标记在图的上方，这些物质与表2A，B中显示的数据相关

5. 皮脂代谢组学：基于当前对帕金森病的理解

通路富集分析被用来探索代谢途径的变化与疾病的发生和发展有关。传统通路分析方法的先决条件是通过光谱和化合物数据库匹配对所有分析检测到的特征进行注释。这是非靶向代谢组学工作流程中的一个主要瓶颈，由于在研究中检测到了大量特征，因此我们使用了Mummichog分析。在对照组和(1)无药物治疗PD组和(2)药物治疗PD组之间进行student-t检验(p值<0.05)。无药物治疗PD组和药物治疗PD组分别有1378和504个特征，在疾病组和对照组之间有显著性差异。

Mummichog分析显示，肉碱穿梭通路是与无药物治疗PD患者最相关的代谢通路(p=0.002)(图4A)。这一途径在药物治疗PD患者中更加重要(图4C)(p=5.09×10⁻⁵)。肉碱穿梭蛋白在酰基肉碱底物辅助下转运到线粒体，促进长链脂肪酸的β氧化，从而参与能量代谢。长链乙酰肉碱减少（与β氧化不足有关）先前已被报道为帕金森病的潜在诊断标记物。我们在虚弱的老年人群(56岁到84岁)中也观察到了肉碱穿梭和维生素E途径的失调。绘制的m/z特征对应于一系列不同长度的酰基-肉碱偶联物的脂肪酸链，由于肉毒碱穿梭是脂肪酸氧化的中介途径，它可以扰动脂肪酸生物合成和脂肪酸代谢途径是合理的，而且它的VIP值大于1也证实了这一点。

假设从PLS-DA模型(VIP>1)注释的其他化合物属于鞘磷脂类化合物(表2)。鞘磷脂代谢途径在无药物治疗PD组和药物治疗PD组中都被富集。鞘磷脂是一类主要的脂类，在人体(如皮肤)的富含脂质的结构中含量丰富，并在细胞信号和调节中起着核心作用。而且α突触核蛋白水平升高和α突触核蛋白在帕金森病皮肤中被破坏是鞘磷脂代谢紊乱的下游效应。鞘磷脂途径的紊乱以前被认为与溶酶体和线粒体代谢缺陷有关，而溶酶体和线粒体代谢缺陷通常与帕金森病和戈谢病等神经退行性疾病的发病机制有关。有趣的是，线粒体失调和帕金森病之间的联系在皮肤成纤维细胞中得到了广泛的证实，但在皮脂中却是前所未有的。最近的研究发现在包括帕金森病、阿尔茨海默病和抑郁症在内的许多疾病中神经酰胺水平都失调了。鞘磷脂由于其在细胞膜中的生物活性作用，与甾醇代谢途径密切相关，并在类固醇合成的调节中起着既定的作用。神经酰胺和胆固醇的生物合成有直接联系，胆固醇是类固醇激素生物合成的底物，这是药物治疗的帕金森病患者体内变化最显著的通路。

图4 Mummichog分析富集的重要通路(P <0.05)

柱状图显示了(a)无药物治疗PD组与对照组和(b)药物治疗PD组与对照组的通路；c，气泡图显示了无药物治疗PD组和药物治疗PD组之间共同的重要通路。

结论

总而言之，本研究对帕金森氏症患者皮脂的非靶向性LC-MS分析显示PD患者的皮脂的组成与对照组有所不同。我们分别针对无药物治疗PD和药物治疗PD进行了单独统计分析，发现两组有十种代谢物是共有的，这表明这些化合物与PD相关，而与多巴胺能药物无关。由无药物治疗PD组和药物治疗PD组的差异代谢物富集得到的通路也存在重叠，这进一步证实了上述结论。就这些患者而言，尚缺乏足够的临床数据来确定皮脂分析有助于分层疾病进展，进一步的试验中将对此展开研究。未来的工作还将专注于靶向鉴定脂质类别，其中包含计算离子迁移率来增强分离并增加化合物鉴定的置信度。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33707447/

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