科研 | 首都医科大学：研究者发现ASPP2基因敲除通过NF-κB途径促进DEN诱发小鼠肝癌的发生（国人佳作）

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编译：微科盟李可爱，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

凋亡刺激蛋白p53-2(ASPP2)是p53结合蛋白家族中的一员，与肿瘤的发生发展密切相关。然而，ASPP2在肝脏炎症和肿瘤发生中的确切机制仍没有确切报道。本研究旨在探讨ASPP2在肝炎和肝细胞癌(HCC)中的作用机制和临床意义，建立了ASPP2基因敲除(APKO)小鼠，以证实ASPP2在肝炎和肝癌发生发展中的作用。我们采用免疫组织化学、Western blotting、蛋白质组学分析、ChIP-Seq和qRT-PCR等实验方法对小鼠的肝组织进行综合分析，以评价ASPP2在DEN诱导的肝炎和HCC中的作用。我们发现APKO促进了肝炎/肝癌的形成，促进了促炎因子的表达。蛋白质组学和Western blotting结果表明，APKO激活了NF-κB信号通路。此外，CHIP-SEQ结果显示，在APKO小鼠中NF-κB靶基因显著增加；相反，QNZ阻断NF-κB通路降低了促炎因子的表达，降低了APKO小鼠对DEN诱发肝癌的易感性。这些结果提示，ASPP2的缺失激活了NF-κB通路，促进DEN诱发肝癌的发生，暗示ASPP2可能是治疗肝癌的潜在靶点。

论文ID

原名：Knockout of ASPP2 promotes DEN-induced hepatocarcinogenesis via the NF-κB pathway in mice译名：ASPP2基因敲除通过NF-κB途径促进DEN诱发小鼠肝癌的发生
期刊：Cancer Gene Therapy
IF：4.534发表时间：2021.02通讯作者：陈德喜,刘晓霓通讯作者单位：首都医科大学附属北京佑安医院

实验设计

实验结果

1.经DEN处理的APKO小鼠容易形成肝炎

DEN对小鼠的治疗可模拟肝脏炎症，诱导肝肿瘤形成。为了探讨APKO在肝炎发生中的作用，我们用DEN诱导WT和APKO小鼠发生肝性肝炎。病理结果显示APKO-DEN小鼠肝脏炎性细胞浸润，Ki67表达明显高于WT-DEN小鼠(图1A，B)。与WT-DEN组相比，APKO-DEN组体重明显减轻(图1C)。为了评估肝组织的功能完整性，我们测量了肝损伤的特异性参数，如ALT和AST(图1D)。DEN治疗后血浆ALT升高，但APKO-DEN组升高幅度大于WT-DEN组。这些数据表明，DEN诱导的APKO小鼠更容易发生肝脏损伤，这可能导致严重的肝炎甚至肝癌。图1 在DEN诱导的肝炎模型中，APKO与炎症之间的关系。肝组织苏木精-伊红(左)和Ki67(右)免疫组织化学染色。条形图(B)表示每个区域Ki-67阳性细胞的平均数(按五个随机区域计数，三只小鼠/组，一段/只小鼠)。C实验8周期间4组大鼠体重比较，检测各组D、ALT、AST的变化。*p<0.05，**p<0.01。
 2.DEN诱导的APKO小鼠比WT小鼠更容易发生肝癌
炎症在肝癌的发生发展中起着关键作用。为了进一步研究APKO在DEN诱导的肝损伤中的作用，我们用DEN诱导了WT和APKO小鼠的肝癌模型。首先，在注射DEN32周后，我们使用磁共振仪器监测肿瘤生长情况，然后处死动物。肝脏病变在T1加权像上表现为信号高度不均匀，与均匀的正常肝组织形成鲜明对比。T2加权像显示肿瘤呈高信号，而正常肝组织呈低信号(图2A)。大体观察显示，DEN治疗32周的小鼠出现肝癌。当注射生理盐水时，APKO小鼠和WT对照组小鼠都没有出现自发性肿瘤(图2B)。与WT-DEN小鼠相比，APKO-DEN小鼠肝癌组织中Ki67阳性细胞显著增加(图2C)。APKO-DEN组的成瘤率(100%)高于WT-DEN组(63.3%)(图2D)。WT组、WT-DEN组、APKO-DEN组和APKO-DEN组小鼠的存活率分别为100.0%、56.5%、88.2%和29.6%(图2e)。结果表明，APKO-DEN组的体重变化明显大于其他组(图2F)。为了评估肝组织的功能及肝损伤的程度，我们测定了肝脏的特异性指标ALT和AST(图2G，H)。APKO-DEN组较WT-DEN组血浆ALT、AST升高。这些数据证实了DEN诱导的APKO小鼠比WT小鼠更容易发生肝癌。图2 与野生型小鼠相比，APKO小鼠对DEN诱发肝癌的易感性显著增加。A.MRI图像：正常肝脏和DEN治疗后肝脏的MRIT1加权像和T2加权像的轴位图。红色圆圈表示肿瘤。B.小鼠肝脏大体形态学观察。箭头指向肿瘤。C.肝组织行苏木精-伊红和Ki67免疫组织化学染色。条形图表示每个区域Ki-67阳性细胞的平均数(在五个随机区域中计数，三只小鼠/组，一块/小鼠)。D.APKO-DEN组和WT-DEN组小鼠肝脏成瘤率。E.不同组别小鼠的存活率。在为期32周的实验中，比较四个不同组的体重。G、H分析各组中反映肝损伤的血浆指标，如ALT、AST。*p<0.05，**p<0.01。

3.APKO激活DEN诱导的肝癌小鼠NF-κB信号通路
为了探讨ASPP2在DEN诱导肝癌发生中的确切分子机制，我们利用蛋白质组学方法对WT-DEN组和APKO-DEN组肝癌组织中差异表达的蛋白质进行了鉴定，共鉴定出4609种蛋白质，主要涉及增殖、代谢、氧化应激、炎症和生物过程(图3B)。通过分析，我们鉴定了32个下调的蛋白质和23个上调的蛋白质(图3C)。对所有改变的蛋白质进行KEGG通路分析，结果显示APKO-DEN诱导的HCC组与WTDEN组比较有20多条通路发生改变(图3A)。在这些信号通路中，我们发现了与肿瘤相关的信号通路，包括NF-κB信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路、PI3K-Akt信号通路和肿瘤坏死因子信号通路。根据先前的描述，ASPP2与NF-κB关系密切，因此我们选择了NF-κB途径进行进一步验证。Westernblotting结果显示，与WT-DEN组相比，APKO-DEN组PIKK、p-IκB和p-P65表达显著上调，p-IKK/IKKα、p-IκB/IκB和p-P65/P65比值明显升高(图3D，E)，暗示APKO激活了NF-κB通路。图3 DEN诱导的APKO和WT肝癌小鼠肝脏蛋白质组学分析。A.对差异表达蛋白的KEGG途径注释表明，ASPP2参与了NF-κB途径。B.在APKO和WT鼠组的比较中，共有4609个蛋白质发生了变化，其中大部分变化的蛋白质参与了细胞的增殖、代谢、氧化应激、炎症和生物学过程。C.以折叠变化>2和p<0.05为标准，共列出32个下调蛋白和23个上调蛋白。D.Westernblotting(D)和统计学(E)分析NF-κB通路相关蛋白的表达。*p<0.05，**p<0.01。

4.促炎症因子和肿瘤相关蛋白在APKODEN诱导的小鼠肝癌中的表达上调
炎症因子在肝癌的发生发展中起着重要作用。因此，我们在这四组小鼠中分析了几种重要的促炎细胞因子。我们发现WT和APKODEN诱导的肝癌小鼠血液中的炎症因子显著增加。其中，APKO-DEN组血中IL-1β(图4A)、IL-6(图4B)和IL-12p70(图4C)水平显著高于WT-DEN组，而TNFα(图4D)两组间无明显差异。这些结果说明ASPP2的缺失促进了肝脏炎症的发展。此外，我们还通过Westernblotting检测了各组三种肝组织中肿瘤相关蛋白的表达水平。与WT-DEN组相比，APKO-DEN组caspase-3表达明显降低，PCNA、CyclinD1和AFP表达显著升高(图4E，F)。这一结果提示APKO可促进DEN诱导的肝脏炎症。图4 在APKO小鼠中，促炎因子和肿瘤相关蛋白的表达水平发生了变化。检测各组小鼠IL-1β(A)、IL-6(B)、IL-12p70(C)和肿瘤坏死因子α(D)的表达水平。Westernblotting(E)和统计学分析(F)肝组织中ASPP2、caspase-3、PCNA、CyclinD1和AFP的表达。*p<0.05，**p<0.01。

5.AsPP2缺失导致APKODEN诱导肝癌小鼠NF-κB靶基因调控的改变
   为了确定ASPP2的缺失是否影响NF-κB调控的靶基因，我们利用CHIP-SEQ对WT和APKODEN诱导的肝癌组的NF-κB结合位点进行了全基因组定位。维恩图显示，在APKO-DEN组，与WT-DEN组的40条信号通路相比，NF-Κb靶基因在117条信号通路中富集(图5A)。进一步分析表明，在WT-DEN组中，与肿瘤相关的信号通路有13条，在APKO-DEN组中，与肿瘤相关的信号通路有32条(图5B)。在这些与肿瘤相关的通路中，WT-DEN组发现了40个基因，APKODEN组发现了75个基因(图5C)。从11条与肿瘤相关的交叉信号通路中选择并列出了5个靶基因(Cadm1、PTPRF、GRK5、Frk和Nfac1)，用于进一步的qRT-PCR验证(图5D)。结果显示，与WT-DEN组相比，APKO-DEN组肿瘤抑制基因Frk的表达显著降低，而肿瘤促进基因NFATC1的表达显著增加(图5e)。结果表明，APKO-DEN组肿瘤抑制基因Frk的表达显著低于WT-DEN组(图5e)，而NFATC1基因的表达显著高于WT-DEN组(图5e)。这些结果提示APKO对NF-κB靶基因的转录有影响，特别是对肿瘤相关基因的转录有影响。图5 NF-κB靶基因的芯片序列分析。为了确定直接的NF-κB靶基因，我们在APKO-DEN和WT-DEN组中进行了NF-κB结合位点的全基因组定位。A.维恩图显示了在APKO-DEN和WT-DEN组中涉及NF-κB靶基因的路径数。B.WT-DEN(向上)和APKO-DEN(向下)组与肿瘤发生有关的路径列表。C.根据通路结果，图中显示了两组富含基因的数量。D.五个选定的NF-κB靶基因和符号的列表。E.RT-qPCR分析WT-DEN组和APKO-DEN组Frk和NFATC1基因的表达。*p<0.05。

6.APKO-DEN诱导的小鼠肝炎模型中促炎因子和NF-κB信号转导途径的研究
   先前的研究结果表明，APKO可上调肝癌小鼠中的前炎性因子，并激活NF-κB信号通路。为了进一步探讨ASPP2在肝炎中的作用，我们分析了APKODEN诱导的肝炎小鼠肝组织中前炎性因子和NF-κB信号通路相关蛋白的表达。结果表明，与WT-DEN小鼠相比，APKO-DEN小鼠IL-1β和IL-6水平升高(图6A，B)，而IL-12p70和肿瘤坏死因子α水平无明显变化(图6C，D)。除了这些促炎因子外，我们还分析了肿瘤增殖相关蛋白(PCNA和cyclinD1)的表达。Westernblotting结果显示，不同组间的表达无显著差异(图6E，F)。但NF-κB信号通路仍处于激活状态。与WT-DEN组相比，APKO-DEN组p-IKK、p-IκB和p-p65表达显著上调，p-IKK/IKKα、p-IκB/IκB和p-p65/p65比值明显升高(图6g，H)。我们同时对WT-DEN和APKO-DEN肝炎组的FRK和NATFC1基因进行了分析。QRT-PCR结果显示，在APKO-DEN组(图6I)，FRK基因显著降低，但NATFC1基因没有改变(图6J)。这些结果提示，在DEN诱导的小鼠肝炎模型中，ASPP2的缺失促进了肝脏炎症的发展，并激活了NF-κB信号通路。图6 APKO在DEN诱导的肝炎模型中的作用。检测各组小鼠IL-1β(A)、IL-6(B)、IL-12p70(C)和肿瘤坏死因子α(D)的表达。Westernblotting(E)和统计学分析(F)肝组织中ASPP2、PCNA和cyclinD1的表达。Westernblotting(G)和统计学分析(H)NF-κB通路相关蛋白的表达。RT-qPCR分析WT-DEN组和APKO-DEN组中frk(I)和NATFC1(J)基因的表达。*p<0.05。

7.APKO通过阻断NF-κB途径减轻DEN诱导的肝癌发生
为了进一步证实APKO通过激活NF-κB途径促进DEN诱导的小鼠肝癌的发生，我们在DEN诱导的小鼠肝癌形成过程中腹腔注射NF-κB途径的抑制剂QNZ。结果显示，与WT-DEN-QNZ组相比，APKO-DEN-QNZ组的成瘤率降低(图7A，B)。APKO-DEN-QNZ小鼠肝癌组织中Ki67阳性细胞数较WT-DENQNZ小鼠明显减少(图7C，D)。对两组患者进行肝功能分析。结果表明，APKO-DEN-QNZ组ALT水平极显著降低，AST水平无明显变化(图7E，F)。炎性因子干扰素-ɤ(图7G)、白细胞介素-1β(图7H)和肿瘤坏死因子α(图7I)在APKO-DEN-QNZ组的表达水平也降低，暗示QNZ注射液能降低DEN诱导的APKO小鼠肝癌的发生率和恶性程度。肿瘤增殖相关蛋白(增殖细胞核抗原和细胞周期蛋白D1)和NF-κB通路相关蛋白(p-IKK、p-I、κB和pp65)在APKO-DEN-QNZ组中也有类似的结果，而APKO-DEN-QNZ组的肿瘤细胞增殖相关蛋白和细胞周期蛋白D1表达降低。综上所述，这些结果表明APKO确实激活了NF-κB通路，从而促进了肝组织的炎症，导致了肝癌的发生。图7 抑制NF-κB通路降低了APKO小鼠对DEN诱发肝癌的易感性。WT-DNE-QNZ组和APKO-DEN-QNZ组肝组织苏木精-伊红(A)和Ki67(C)免疫组织化学染色。条形图(D)表示每个视野Ki-67阳性细胞的平均数。图中显示了这两组中有瘤小鼠和无瘤小鼠的数量，测定各组ALT(E)、AST(F)。检测白介素1(β，G)、白介素6(IL-6，H)、肿瘤坏死因子α(I)在去甲肾上腺素(WT-DNE-QNZ)组和APKO-DEN-QNZ组的表达。Westernblotting(J)和统计学分析(K)肝组织中ASPP2、PCNA和CyclinD1的表达。Westernblotting(L)和统计学分析(M)NF-κB通路相关蛋白的表达。*p<0.05。

讨论

ASPP2具有广泛的生物学功能，包括凋亡、自噬和炎症反应。最近的研究表明，ASPP2是一种潜在的肿瘤抑制因子，可以增强肝癌药物的敏感性，但其在肝癌发生中的作用尚不清楚。肝癌的发生与炎症密切相关。ASPP2可能在肝脏炎症中起双重作用。一份报告显示，ASPP2的单倍体缺失通过激活自噬、抑制炎症和凋亡来保护CCl4诱导的急性肝损伤。在LPS诱导的雌性大鼠炎症模型中，LPS通过血脑脊液屏障(脑炎性屏障)诱导ASPP2的表达，而血脑脊液屏障介导LPS诱导的细胞凋亡。与ASPP2作为炎症看门人的作用一致，ASPP2缺陷的大脑表现出增强的神经炎症。ASPP2在肝癌发生中起什么作用？ASPP2是否与炎症有关？在体外研究中，我们的研究小组已经报道了在肝癌细胞系中过表达ASPP2，这在以前的研究中诱导了细胞凋亡。为了进一步研究ASPP2在体内肝癌发生中的作用和机制，我们建立了以APKO小鼠为模型的DEN诱发肝癌模型。结果表明，DEN连续给药32周后，APKO小鼠肝癌发生率明显高于野生型小鼠，肝功能出现明显损害，肝脏促炎因子和增殖性肿瘤蛋白水平明显升高。NF-κB通路是重要的炎症信号通路之一，也是炎症与癌症之间的关键介质。NF-κB在肝癌组织中被激活，与肝癌的发生、发展和预后密切相关。我们的蛋白质组学和WB结果表明，DEN处理后，APKO小鼠的NF-κB通路被激活。芯片序列分析显示，NF-κB靶基因在APKO小鼠和野生型小鼠中的表达有显著差异。Fyn-Relatedkinase是Src相关酪氨酸激酶家族中的一员，该家族包括PTK6和SRMS。Frk介导PTEN的酪氨酸磷酸化，抑制PTEN与NEDD4-1的结合，进而抑制肿瘤。NFATC1(活化T细胞核因子)是NFAT家族的成员，是免疫应答的关键调节因子。NFATC1过表达可促进多种肿瘤的发生、发展和转移，是一个不良的预后因素。FRK和NFATC1都是NF-κB的下游靶基因。在本研究中，经DEN处理后，FRK基因显著下调，NFATC1基因显著上调。这些结果提示，ASPP2的缺失促进了DEN诱导的小鼠肝癌的发生，这可能是通过激活NF-κB通路和调节肝脏中炎症因子和肿瘤相关基因的表达来实现的。我们还观察了DEN处理8周后APKO小鼠的肝脏变化。结果发现，与WTDEN组相比，APKO-DEN组炎症细胞浸润、炎性因子和Ki67表达增加，NF-κB通路活化和Frk基因表达降低。这些结果提示，APKO可促进DEN诱导的小鼠肝脏炎症，这可能是肝癌进一步发展的基础。为了进一步验证APKO是否激活了NF-κB通路，在DEN处理过程中，APKO小鼠和野生型小鼠同时给予NFKB通路抑制剂QNZ。QNZ被发现能显著降低APKO小鼠肝癌的形成。进一步证实，ASPP2缺乏可显著激活NF-κB途径，调节肝脏炎症因子和肿瘤相关基因的表达，促进DEN诱发小鼠肝癌的发生。综上所述，我们的研究结果显示ASPP2缺乏是DEN诱发肝癌发生的关键驱动因素。在这种疾病中，ASPP2的缺失可以通过激活NF-κB途径来影响炎症因子和肿瘤相关基因的表达，并可以促进肝脏的炎症，从而支持癌症的发生，如图8所示。图8 ASPP2在肝炎和肝癌发生中可能作用的示意图模型。综述了ASPP2通过NF-κB途径在肝癌发生中的作用。→：正向调节；↔：双向调节；-Ι：负调节。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33558702/

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