科研 | GCB Bioenergy: 甲烷生物转化过程中煤炭的初始产物是什么？

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编译：微科盟萌依依，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读尽管微生物降解煤生产生物甲烷的过程已经得到了很多研究工作的关注，但目前对煤在产甲烷生物转化初期的产物仍不清楚。本研究从产甲烷菌群中分离鉴定了5株煤炭降解菌(CD1、CD10、CD20、CD24和CD25)。其中CD1和CD24属于Paenibacillus sp.，CD10和CD20属于Bacillus sp.，CD25属于Stenotroomonas sp.。褐煤和烟煤经过生物处理后，新生成的化合物种类分别为33种和45种。代谢组学分析表明，微生物降解烟煤和褐煤后产生了大量的烷烃类化合物和杂环芳烃类化合物，且大部分化合物是以羟基化或酰化方式产生的，说明微生物初始处理提高了煤的生物利用率。在上述产品中还检出了生物碱和生物表面活性剂,这些微生物代谢产物在煤的降解过程中可能起着重要的增溶作用。本研究加深了对产甲烷生物转化煤的复杂代谢过程的理解，并通过合适的代谢策略使有效生产生物甲烷成为可能。

论文ID

原名：Deciphering the initial products of coal during methanogenic bioconversion: Based on an untargeted metabolomics approach译名：破译产甲烷生物转化过程中煤炭的初始产物：基于非靶向代谢组方法
期刊：Global Change Biology Bioenergy
IF：5.316发表时间：2021.03通讯作者：余志晟
通讯作者单位：中国科学院大学

实验设计

实验结果

1. 煤炭降解菌的分离与鉴定
在筛选培养基上培养7天后，平板上生长的菌落大致可分为两种形态。表面粗糙的菌落较大，表面光滑的菌落较小(图S1)。本研究提取了20多个菌株的基因组，经16S rRNA基因扩增后，经Sheng Gong生物科技有限公司测序，将大部分序列分成3个不同的属，选择了5个不同序列的菌株进行后续实验(表1)。表1 以煤为唯一碳源的分离菌株的基本信息^a对分离株的16S rRNA基因进行部分测序，使用该序列对NCBI数据库进行BLAST搜索，对分离出的菌株进行鉴定。^b分离物的门和科水平上的分类。
系统进化树分析表明，菌株CD1的16S rRNA基因序列与 Paenibacillus macerans sp.的16S rRNA基因同源性为99%，CD10菌株的16S rRNA基因序列与Bacilluscereus的16S rRNA基因序列同源性为99%，CD20菌株的16S rRNA基因与Bacillusidriensis sp.的16S rRNA基因同源性为99%，CD24菌株的16S rRNA基因序列与Paenibacillusbarengoltzii sp.的16S rRNA基因同源性为99%(图S2)。因此，本研究将菌株CD1鉴定为Paenibacillus sp.，菌株CD10鉴定为Bacillus sp.，菌株CD24鉴定为Paenibacillus sp.，菌株CD25鉴定为Stenotroomonas sp.。菌株CD10和CD20隶属于Firmicus 门Bacillaceae科。CD1和CD24隶属于Firmicus门 Paenimatacea科。CD25属于Proteobacteria门Xanthomonadaceae科。
2. 样品的总体差异分析    本研究以褐煤和烟煤为研究对象，采用LC-MS技术对菌株和微生物群落进行了代谢组学研究。未加权的基于距离的主坐标分析(PCoA)被用来识别和揭示非生物处理（对照）、微生物群落和分离菌群处理之间的差异产物。PCoA图显示，在含褐煤和含烟煤的培养物中，生物处理组和非生物处理对照组之间的产物分布有明显的区分(图1)，这表明煤炭经过生物降解后的产物存在显著差异。作者从打分图（score plots）中看观测到，微生物群落组的产物剖面与分离物组的产物剖面距离较远。PCoA打分图的结果表明，不同分离菌株对煤的微生物降解产物有很大的不同。为了识别煤经过微生物群落处理和分离菌株处理的产物总体差异，作者统计了不同处理中鉴定出的产物数量，并根据其相对分子质量进行了划分。如图2a所示，大多数褐煤产物的相对分子质量集中在600-900之间。然而，微生物群落处理组和菌株处理组的产物质量分布不同。微生物群落处理组的相对分子质量较高(600~1300)的产物少于菌落处理组，而低相对分子质量(0~600)的产物则高于菌落处理组。这可能是由于微生物群落中的协同微生物进一步利用了最初的煤炭降解菌株的大分子产物，因此产生了初始产物。烟煤样品的相对分子质量分布与褐煤样品非常相似(图2b)。这些结果表明在协同产甲烷群落中，单独培养和共培养时细菌的降解行为是不同的。因此，本研究以煤炭直接降解菌为研究对象，利用比较代谢组学方法对煤炭直接降解菌的代谢产物进行了分析，以探索煤炭降解菌的初始产物。图1 基于褐煤(A)和烟煤(B)在非生物处理对照、微生物群落和分离菌株组中的代谢概况的PCoA打分图
MC，微生物群落；PCoA，主坐标分析。
图2 褐煤(A)和烟煤(B)样品在微生物群落和分离菌株处理下的代谢物的计数和相对分子质量
 3. 比较代谢组学分析
作者将筛选出的5株煤炭降解菌，分别接种在以烟煤或褐煤为唯一碳源的液体培养基中培养，不接种微生物的液体培养基为对照。如图3所示，来自生物处理组和非生物处理组的一些常见的化合物的相对含量明显下降，表明煤中的可降解组分已经发生了微生物降解。有趣的是，来自生物处理组和非生物处理组的一些常见的化合物的相对含量显著增加，这表明微生物的活性可能有助于这类物质的溶解。图3 五株煤炭降解菌生物处理褐煤(A)和烟煤(B)及未经生物处理的褐煤(A)和烟煤(B)常见产物的变化
两组中存在的化合物水平均归一化到内部标准水平。不同颜色的圆点代表相应的煤炭降解菌株的生物处理组，而玫瑰色的圆点代表未处理的对照组。
此外，褐煤微生物降解后，正离子和负离子模式下新生成的化合物有33种物质，而正离子和负离子模式下检出的烟煤新生成的化合物有45种物质。如图4所示，尽管五株煤炭降解菌的产物含量存在差异，但这五株细菌的大部分产物是相同的。一般说来，这些化合物根据其化学结构可分为三类。它们是烷烃化合物、杂环芳香化合物和微生物代谢副产物。

图4 五株分离菌株对褐煤(左)和沥青(右)降解产物的热图

红色越深，被测样品中含量越高；同样，蓝色越深，被测样品中含量越低。在此网格中，每列表示每个煤炭降解菌株产生的化合物，每行对应于样品。

4.褐煤降解菌的初始产物
5种微生物对褐煤的降解产生了17，21-二甲基庚烷、3-氧代十四烷基辅酶A，卡巴他赛(cabazitaxel)，脱甲基他克莫司、二甲基他克莫司、甘氨酚、N-(26-羟基己烷)鞘氨醇、N-鸟氨基-35-氨基-32，33，34-三环-1，5-磷等烷烃类化合物。同时，还合成了26，27-二甲基胆钙醇、乙酰基己二酸酐、24，25-二氢甾醇、6-α-羟基皮质醇等杂环芳香族化合物合成葫芦素P，3，7，胆甾醇-5-烯-3，7，12-三醇等。
5. 煤降解菌对烟煤初始产物的研究
5种微生物在烟煤降解过程中产生的烷烃包括：3-氧代十四烷基l-CoA、卡巴他赛（cabazitaxel）、脱甲基他克莫司、二脱甲基他克莫司、甘氨酚、N-(26-羟基己烷)鞘氨酸、(S)-3-羟基十四酰-辅酶A、N-鸟苷酸-35-氨基-32，33，34-三醇，7-乙酰-3-氨基-3-羟基十四烷基辅酶A，N-鸟苷酸-35-氨基-32，33，34-三醇，7-乙酸异戊二醇酯(S)-3-羟基十四酰-辅酶A，N-鸟苷酸-35-氨基-32，33，34-三醇，7-乙酰。同时，烟煤生物降解后产生的杂环芳香族化合物包括6-羟基皮质醇、24，25-二氢甾醇、葫芦素P、七叶皂甙E、二萜酸、赤霉素A1、三七皂甙D、单甘草酸酯、三七皂苷J、五谷氨酸叶酸、萨尔萨皂甙元、D-葡萄糖醛酸和胆甾烯-5-烯-3β。烟煤5种微生物降解产生的代谢副产物主要包括甘油磷胆碱、原阿片碱B、螺内酯E、抗肽A、马钱子碱、亮氨酸激肽I、微球菌、诺西肽、表面蛋白、表面活性素、微管溶素A、微管溶素E等生物碱和活性蛋白。
6. 五个菌株以褐煤和烟煤为原料的共有产物
从5个菌株中可以发现褐煤和烟煤的共有的产物有24种(表2)。这些化合物在所有三个分类中都有分布。用方差分析比较褐煤和烟煤中共有化合物的相对丰度是否有显著差异。如表2所示，褐煤和烟煤生成的烷烃类化合物和杂环芳香族化合物的p值除6α-羟基皮质醇外，其余均大于0.05，说明不同煤中共有产物的相对丰度差异不大。烟煤和褐煤的共同产物可能都来自烟煤和褐煤中相同的前驱体。一种可能的推测是，分离的菌株显示出与这些前体相似且较低的降解潜力，这导致烟煤和褐煤之间的这些共同产物没有差异。然而，烟煤的代谢副产物表面素产率(0.3901±0.0027 SD)高于褐煤的代谢副产物表面素产率(0.1479±0.0012 SD)。表2 烟煤和褐煤常见化合物的相对丰度比较方差分析

讨论

煤是一种复杂的有机聚合物，不易通过化学和物理手段降解。生物转化过程可以将煤逐步转化为甲烷。为了了解产甲烷煤生物转化后期的重要中间体，如醋酸盐、二氧化碳、氢气、甲醇等，人们做了大量的研究。本研究利用产甲烷菌群分离的微生物单独降解煤炭，并利用代谢组学方法揭示这些微生物在煤炭降解过程中产生的化合物。本研究对煤生物转化初期的代谢中间产物有了新的认识。从产甲烷微生物群落中分离到的煤炭降解菌在煤炭生物转化的启动过程中起着重要作用。在以煤为唯一碳源的厌氧基础培养基上分离到的菌株分属于Bacillus、Paenibacillus和Stenotrophomonas 3个不同属。有趣的是，以前从未报道过Stenotrophomonas能降解煤炭。Stenotrophomonas可以降解不同的外来物质，并能将难降解的酚类化合物转化为易于生物降解的化合物。在最近的一项研究中，研究者利用Stenotrophomonas可以提高生物膜序批次反应器处理煤气化废水的启动和稳定性。从煤矿环境中分离的Bacillus和Paenibacillus微生物已被广泛报道能够降解煤炭。本研究分离的菌株大多还属于Bacillus和Paenibacillus。然而，由于传统分离和培养方法的限制，很难揭示无法培养的类群。为了充分揭示产甲烷煤生物转化初期的代谢产物，可以用不同的现代创新筛选方法分离出更多的煤炭降解菌来实现培养。煤降解菌处理的烟煤中检测到的化合物明显多于褐煤。这部分代谢产物主要是烷烃和多环芳烃大分子化合物，如7-乙酰基紫杉醇、C30烷基葡萄糖苷酯、七叶皂甙E、二萜酸、赤霉素A1、二萜酸、三七总皂苷D、单甘草酸、三七皂苷J、五谷氨酰叶酸、萨尔萨皂苷元、海德林（Hederin）等，这可能是由于褐煤具有较高的生物利用度所致。不过，在烟煤和褐煤处理组中仍发现大量常见物质。这些常见的化合物主要由长脂肪碳链及其羟化或酰化产物以及多环芳烃(如羟基苯、萘等)组成。Youtcheff曾在澳大利亚烟煤中发现过一些长链烷烃(C8-C30)。在不同煤级的煤提取物中也发现了多环芳烃，如酰化或羟化菲和萜类化合物。但正如这项研究显示的那样，还有更多未报告的化合物产生。其他协同微生物需要更多不同的代谢策略来进一步降解这些新产生的代谢物。有趣的是，在经过微生物处理的煤的代谢物中也检测到了许多微生物代谢副产物，包括生物活性生物碱和表面活性剂。在以前的研究中，Maka等发现芽孢杆菌属(Bacillus sp.)能够分泌一种分子量在3000到30,000之间的极性水溶性大分子生物碱，它可以溶解煤基质。然而，该大分子生物碱的化学成分尚未确定。本研究在煤的生物代谢产物中检测到大量的甘油磷胆碱、丙戊酸甲酯、丙戊酸B和马钱子碱等生物碱，可能在煤的溶解过程中起关键作用。此外，从产品中检测到的表面活性素有可能对煤的生物有效性起到促进作用。表面活性素是一种由细菌产生的具有极性亲水性氨基酸头和碳氢链尾部的环状脂肽，以其优异的表面活性剂能力而闻名，它能将水的表面张力从72mN m⁻¹降至27mN m⁻¹。生物表面活性剂对煤基质的增溶和多环芳烃污染物的修复已被广泛报道。这些微生物代谢副产物可能在煤炭生物转化过程中发挥重要作用。图 5 根据烟煤和褐煤产物的化学结构特征，提出了筛选菌株降解煤的途径
对Fakoussa和Hofrichter提出的不同煤级煤的典型结构模型进行了修正。R代表煤中化学基团的剩余部分。 值得注意的是，细菌对煤的降解以酰化或羟化的方式产生了大量的烷烃和芳香族化合物，说明产甲烷煤生物转化初期微生物的活性可以提高煤的生物利用率。复杂大分子的羟基化被认为在煤的厌氧降解过程中起着重要作用；羟化的大分子可以进一步反应生成脂肪酸等代谢物。代谢产物中的羟基烷烃(大于36个碳原子)可被节杆菌属、不动杆菌属、假丝酵母属、假单胞菌属、红球菌属、链霉菌属和芽孢杆菌属进一步氧化为二氧化碳。在末端电子受体如硝酸盐、硫酸盐和铁的存在下，烷烃和碳原子少于30个的芳香族化合物可被各种厌氧氢利用微生物（如产甲烷菌或硫酸盐还原菌）进一步降解， PAHs如菲等多环芳烃可通过2-萘甲酰辅酶A中间体在厌氧条件下通过羧化或甲基化进一步降解。Strąpoć和他的合作者假设了产甲烷煤的生物转化模型，在该模型中，在煤炭降解的初始阶段，煤中释放出长链烷烃和多环芳烃，并被产甲烷微生物群落进一步转化。在本研究中，从煤中分离的菌株产生的烷烃和芳香族化合物可以作为一种合适的基质，通过引入富马酸或羧化作用来进一步厌氧降解。在代谢组学分析的基础上，作者假设了由选定的菌株从烟煤和褐煤中获得产物的可能途径(图5)。由于复杂的煤基质的顽固性、异质性和疏水性，煤的降解需要微生物群落采取一系列代谢策略。Fakoussa和Hofrichter提出，煤炭生物降解的初始步骤可能是在氧气条件下由生物增溶和胞外酶解聚催化的。在本研究中，在缺氧条件下，生物处理组还检测到可能参与煤的生物增溶的生物表面活性剂和生物碱。因此，在最初的产甲烷生物转化过程中，煤的生物增溶作用也可能对煤的解聚起重要作用。Strąpoć等人已经提出了涉及芳香烃和脂肪烃等煤组分厌氧活化的羟基化途径。在本研究中，最常见的产物是那些与煤的芳香族核心的微生物羟基化一致的产物，如三醇、甾醇和环醇，这些在未经生物处理的组中没有出现。此外，部分产物还具有酰基辅酶A结构。产物具有酰基-辅酶A结构，是辅酶A(CoA)附着在长链底物末端时形成的临时化合物。然后，该化合物将形成一个或多个乙酰辅酶A分子，它反过来又进入柠檬酸循环。综上所述，本研究为煤在生物甲烷生产过程中的初始产物研究提供了重要的启示。从产甲烷微生物群落中分离鉴定了5株煤炭降解菌(CD1、CD10、CD20、CD24和CD25)。其中，CD1和CD24属于Paenibacillus sp.，CD10和CD20属于Bacillus sp.。CD25属于Stenostroomonas sp.。代谢组学研究结果表明，被分离细菌降解的烟煤和褐煤产生了大量的烷烃和杂环芳香族化合物，且大部分化合物发生了羟基化或酰化反应。此外，微生物还会分泌一些生物碱和生物表面活性剂，这定然对煤的降解起到积极的作用。这些结果表明，微生物对煤的初始降解在产甲烷煤的生物转化过程中起着重要作用，微生物可以利用各种代谢策略为煤的进一步降解提供丰富的底物。当然，我们仍然需要进一步研究哪些中间代谢物在产甲烷条件下是可生物降解的，以及产甲烷群落的哪些成员对其降解负责，以描绘更完整的产甲烷煤生物转化代谢模型。

原文链接：  

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/gcbb.12824

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