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科研 | J. Cachexia Sarcopenia Muscle：研究者揭示了患肿瘤恶病质小鼠的一些主要的肝脏和小肠的扰乱
编译：微科盟向阳而生，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
微科盟原创微文，欢迎转发转载。
恶性肿瘤是一种多因子综合症，其特征是多种代谢紊乱。除了肌肉，其它器官比如肝脏以及内脏微生物菌落可能也作用于此综合症。事实上，内脏微生物菌群，一个宿主代谢重要的调控因子，在C26恶性肿瘤潜伏期模型中发生了变化。针对内脏菌群进行靶标性干预已经表现出一些效果，但是研究者对其背后的宿主-微生物交互作用的机制的理解仍然不足。为了研究此相互作用，我们结合了多个层次上的质子磁阻（1H-NMR）代谢物组学和16S rDNA测序。这些分析通过分子和生化分析，以及肝脏转录组学共同完成。1H-NMR揭示了对照组（CT）和恶性肿瘤组（C26）两组在4个已经分析的水平上的差异（例如：盲肠内容物，门静脉，肝脏以及腔静脉）。更加具有针对性的是，C26模型中葡萄糖分解代谢通路、糖质新生和激活氨基己醣通路发生了变化，与该模型中柯里氏循环存在的观点相矛盾。同时，由肝脏吸收的氨基酸，具有高达4倍的9种氨基酸的沉积（q < 0.05），主要用于急性响应期的蛋白质合成而非在糖质新生过程中三羧酸循环中提供燃料。我们同样也发现肝脏肉碱水平降低了35%（q < 0.05），而卵磷脂代谢通路作为此模型中出现的肝硬化现象的潜在作用者激活程度较低。我们的工作也揭示了在恶性肿瘤中不同的肠道有益细菌活性的下降。我们发现两种短链脂肪酸，醋酸盐和丁酸盐（在C26盲肠内容物中下降分别为72%和88%，q < 0.001）水平的下降，以及芳香类氨基酸代谢物水平的下降，这种下降可能与这些小鼠肠道稳态的改变有关，一种疣微菌科家族成员（ASV2）被鉴定为丁酸盐水平下降发挥作用的主要细菌。最终，我们报道了肠道转运速率的增加（p < 0.001）是塑造消化道菌群组成和恶性肿瘤活性的关键因子，它们共同导致了粪便中蛋白质和氨基酸的丧失。我们的工作聚焦了与恶性肿瘤潜在相关的新代谢通路并在癌症病人和未患恶性肿瘤病人中进一步探索了肠道菌群的组成和活性，以及肠道转运机制。
论文ID
原名：Multi-compartment metabolomics and metagenomics reveal major hepatic and intestinal disturbances in cancer cachectic mice译名：多层次代谢物组学以及宏基因组学揭示了患肿瘤恶病质小鼠的一些主要的肝脏和小肠的扰乱
期刊：Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle
IF：9.802发表时间：2021.04通讯作者：Laure B. Bindels
通讯作者单位：天主教鲁汶大学
实验设计
实验结果
在C26小鼠中恶病质的存在基于体重、摄食量以及肌肉量的下降而被确认（图S1）。我们收集了肝脏，盲肠内容物（CC），门静脉血以及全身血液的样本，并且获得了来自这些样本的1H-NMR谱。首先用多变量的统计工具进行分析。PCA分析通过光谱智能降压（图S2a-S2d）和代谢物相关的浓度表（图1A-1D）进行，在四个不同层次上的CT和C26样本之间表现出清楚的差异。这种差异，主要发生在第一个主成分（PC1），显示出恶病质是引发这些数据集发生变化的主要原因。CT和C26代谢物组学谱之间显著的差异在采用每个组的叠加谱时同样可见（图S2e-S2h），我们在4个不同水平上（表S1）均鉴别出最大数目的代谢物。我们进一步采用了一种相对定量方法，描绘了每种代谢物在4个水平上的倍数变化（图2），用一个描述性的表呈现出倍数变化和统计量（表S3）。乍看起来，大多数被鉴别出的代谢物在恶病质和CC肝脏中上升，而在门静脉以及全身血液循环中下降（图1E-1H和图2）。代谢物被分为5个类别以辅助解释和讨论：与葡萄糖代谢、能量状态、氨基酸、脂类代谢、以及肠道菌群相关的代谢物。
2. 恶病质小鼠显示出葡萄糖代谢通路的改变以及表现出能量缺乏
被鉴别出的与肝脏中葡萄糖代谢、以及门静脉和全身血液循环相关的代谢物的变化表明葡萄糖相关代谢物的耗尽。图3A总结了肝脏中可观察到的改变，糖原、葡萄糖以及乳糖下降，而UDP-葡萄糖在C26肝脏中上升，其他鉴别出的代谢物在CT和C26小鼠间无变化。在C26中，PV，CV，葡萄糖，乳糖，丙酮酸盐以及柠檬酸盐都表现出下降，这些变化主要证实了之前的代谢组学研究在C26小鼠血清和肝脏中的研究结果。我们也发现葡萄糖以糖原形式存储量以及葡萄糖本身的下降。这可以通过这些小鼠的饥饿状态以及下降的食物摄取量（图S1a-S1b）所解释，而鉴别出的TCA循环中间代谢产物未发生改变。
这些数据是来源于独立的小鼠试验中肝脏全转录组分析的结果。葡萄糖激酶（Gk），一种在转录组水平关键的受到调节的糖酵解酶类，在C26小鼠中的下降反映了肝脏葡萄糖酵解的下降（图3B）。我们不能排除肝糖原和血液中葡萄糖的下降也能够成为肝外组织葡萄糖需要量和消耗量增加的原因。更加令人惊讶的是，两种葡萄糖异生作用酶类Pck1和G6pc，分别是香醇丙酮酸激酶和葡萄糖-6-磷酸酶，在转录水平受到调控，在C26小鼠中分别表现为无变化和下降（图3B）。G6P激酶也催化了葡萄糖异生作用的终末步骤。催化亚基G6pc表达量的下降包括了肝糖原的下降和血浆中高的IL6水平。恶病质小鼠肝脏中缺乏葡萄糖异生激活作用与通常提到的在癌症恶病质中无用的柯里氏循环假设相悖。在全身血液循环和肝脏中乳糖的下降，可能反映了降低的肌肉和肝脏的糖酵解作用而非增加的肝脏中乳糖-葡萄糖通过葡萄糖异生作用的转换。这些酶类表达形成的丙酮酸脱氢酶复合物：Pdha1，Dlat，以及Pdhx的表达量下降（图3C）。该复合物对于丙酮酸盐转化成为乙酰辅酶A并且后续进入TCA循环有效，这些酶类表达的下降表明在TCA循环中葡萄糖来源的丙酮酸盐进入的下降，在C26模型中最近的肝脏蛋白组学研究也显示出PDHX的下降。总之，这反映了C26小鼠肝脏中提供ATP的氧化通路的减少，与之前的研究中报道的在癌症恶病质中肝脏线粒体氧化磷酸化效率的下降一致。C26小鼠肝脏中AMP，GMP以及UMP水平的上升（图2）以及AMPK（图3D）的激活进一步支持此观点。
3. 在恶质化小鼠氨基己醣通路激活后糖酯化作用下降
我们也观察到UDP-葡萄糖和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖（图2）在肝脏内的聚集。UDP-葡萄糖是葡萄糖醛酸的前体物质，葡萄糖醛酸是葡萄苷酸化所需的共作用因子。葡萄糖醛酸的聚集，与Ugdh较低表达量一起，编码了UDP-葡萄糖-6-氢化酶（一种在mRNA水平调控的关键酶类），表明葡萄糖苷酸化水平的降低。该假说通过编码鼠类主要UDP-葡萄糖醛酸转移酶Ugt2b5，Ugt2b1和Ugt2b36较低的mRNA水平进一步加强（图3E）。
UDP-N-乙酰葡萄糖胺的增加可通过较低的葡萄糖酵解速率以及氨基乙醣合成通路的上调所解释（图2和S3a）。后者的增加最有可能来自内质网应激，该应激过程与癌症恶病质的关系已被阐明，但是其确切的机制仍未知。事实上，Xbp1s，最为保守的非折叠蛋白响应的信号转导蛋白，在C26肝脏中上升（图S3b）并且显示通过Gfpt1的转导激活氨基己醣通路。后者编码了氨基己醣通路的限速酶并且在转录组水平受到调控。与此假设一致的是，Gfpt1的表达在C26肝脏中显著上升（图S3a）UDP-乙酰葡萄糖胺在蛋白的转录后修饰过程中发挥重要作用，此蛋白能够影响信号转导过程。有趣的是，GlycA，一种与APR蛋白结合的N-乙酰多聚糖聚合信号的升高，被认为是一种新的全身性炎症的生物标记并且在之前C26模型血清代谢物组学中被观察到。进一步的观察支持通过UPR激活氨基己醣通路的观点，导致增加的O-葡萄糖乙酰化并因此影响信号转导过程。
4. 被恶病质小鼠肝脏捕获的氨基酸主要是针对急性期响应蛋白合成
几乎所有来自肝脏的氨基酸在C26小鼠中上升，而这些氨基酸大都在门静脉和全身血液循环中消失（图2）。这些必需和非必需氨基酸具有各种不同的结构和用途：支链氨基酸、芳香化氨基酸、带电荷的氨基酸、以及生酮的和葡萄糖生成作用的氨基酸。血浆中支链氨基酸的显著下降已经在恶病质模型中被报道。值得注意的是，苯基丙氨酸的血清浓度最近被认为是癌症恶病质的生物学标记，在C26小鼠全身血液循环中其浓度上升。重要氨基酸的吸收量在肝脏中提高主要是由于蛋白质水解，事实上，正如表1所示，大量肝脏氨基酸转录蛋白的转录水平上升，这些蛋白独立于优先的转录底物。肝脏对氨基酸的摄入通常被认为是为肝脏糖质新生提供燃料。但是，正如之前所提到的，这种机制在C26模型中似乎并不奏效。两种与糖质新生有关的关键酶，Pck1和G6pc（图3C）表达量降低。丙氨酸氨基转移酶（Gpt，L2FC：-0.52，q < 0.001；Gpt2，L2FC：-0.69，q < 0.001）是尿素产生过程的一种关键酶类（Cps1，L2FC：-1.31，q < 0.001），也是与全身尿素水平相关的关键酶类（CT：38.56 ± 2.04mg/dL相对于C26：27.52 ± 2.85mg/dL，p < 0.01），这与氨基酸作为糖质新生和三羧酸（TCA）循环燃料的观点相悖。在此模型中，载入的氨基酸可能主要用于APR蛋白质合成。事实上，我们观察到三种主要的小鼠APR阳性的蛋白编码基因Apcs，Saa1以及Saa2表达的大幅度增加，以及主要的APR阴性的蛋白编码转录本的下降Alb（图4）。表1 大多数氨基酸转运蛋白在恶病质小鼠的mRNA水平上上升
阳性APR蛋白质在恶病质模型中的提高在临床和潜伏期模型中都发生了上升。虽然在恶病质个体肝脏中糖质新生过程使用的氨基酸通常被提到，但是一项在恶病质大鼠中进行的相似的研究也观察到APR蛋白以葡萄糖产生为代价的合成。他们证明了即使肝脏吸收的必需氨基酸和糖质新生所需的氨基酸的量出现上升，葡萄糖和尿素的产生仍然未发生改变。他们得出的结论是肝脏在这种情况下，是一种有效的氮元素保护以及蛋白质合成激活的器官，而在患结肠癌的恶病质病人中，蛋白质合成的增加可靶向输出蛋白。为了平衡增加的蛋白质合成，肝脏能够通过降低结构性蛋白的转化从而保护氮元素。在C26模型中，一项功能性的检测证实了肝脏蛋白质合成的增加。另外，我们观察到Atg7（L2FC：-0.53，q < 0.001），一种关键的自噬调节蛋白，以及Smurf1（L2FC：-0.42，q < 0.001），一种肝脏中重要的E3泛素化蛋白连接酶，在氮元素保护过程中蛋白质降解水平下降。Atg7在另一个恶病质（LLC模型）潜伏期模型中下降，该模型报道了伴随着癌症病程发展的自噬作用的下降。考虑到肝脏水平的自噬功能响应饥饿作用显著增加是令人惊讶的。但是，氨基酸水平，特别是亮氨酸和谷氨酰胺，能够激发出更强的自噬作用，相比正常个体，其自噬作用高2-4倍。这两种氨基酸在C26肝脏中（图2和表S3）的增加能够解释并支持肝脏蛋白质降解所导致的下降，即使在饥饿状态下。我们所观察到的表明这些自噬过程中的偏差可能影响了癌症恶病质中肝脏的功能。
5. 肉毒碱和胆碱代谢的改变可能参与了恶病质中观察到的脂肪变性
肉毒碱，一种氨基酸衍生物，对于脂肪酸分解代谢是必需的，在C26小鼠的血清和肝脏中显著下降（图2）。这种血清中肉毒碱水平的变化在患癌症恶病质病人和潜伏期癌症恶病质模型中已被报道。肝脏中肉毒碱的下降反映了肝脏线粒体β-氧化作用进一步参与了能量耗减的状态。这些酶类的低表达分别作用于线粒体β-氧化的第一步和终末步骤，Acadm（L2FC：-0.51，q < 0.001）以及Acaa2（L2FC：-1.22，q < 0.001），进一步支持此观点。但是Ppargc1a，一种转录水平的共激活调控因子，参与了线粒体脂肪酸氧化过程的表达水平，还有Cpt1a，参与了线粒体乙酰化过程，都未发生变化。CPT1活性的变化已经在潜伏期恶病质模型中被报道，但是在mRNA水平上无变化。一些研究也报道了添加肉毒碱在携带肿瘤的小鼠和大鼠中可以恢复CPT1的活性，这导致癌症恶病质综合症的提高以及这些动物中肝硬化的减轻。基于哺乳动物的日粮配方，外源性的肉毒碱摄入以及内源性的肉毒碱生物合成的改变。采用经典啮齿动物日粮配方饲喂的小鼠可利用赖氨酸和甲硫氨酸内源性的合成肉毒碱。在我们的试验中，肉毒碱生物学合成的通路下降，这与下降的肉毒碱浓度相吻合（图5A）。事实上，所有酶类的表达，包括关键的限速酶Bbox1（γ-丁内铵盐水解酶1）表现出显著的下降。因此我们得出结论：肉毒碱的下降，很可能是由于其生物学合成的降低所造成，可能通过线粒体β氧化的限速步骤作用于这些小鼠的肝硬化过程（图5B）。我们的代谢物组学分析指出了另一条可能作用于肝硬化过程的通路，主要是卵磷脂通路。胆碱和O-磷酸胆碱的水平上升，而卵磷脂的生物学合成似乎在患癌症恶病质的小鼠中下降（图2和5c）。事实上，我们发现卵磷脂生物合成酶类表达量的降低，特别是限速酶Pcyt1a。另一条通路导致了卵磷脂在肝脏中的合成，其中Pemt为一种关键酶类，在C26小鼠中也表现为下降（Pemt，L2FC：-0.42，q < 0.001）。由于卵磷脂参与了VLDL（超低密度脂蛋白）的合成，较低的生物学合成会影响甘油三酯通过VLDL的输出并因此作用于C26小鼠中甘油三酯的聚集（图5B）。与我们的假设一致，一项之前的研究记录了肝脏VLDL在C26模型中分泌的下降。长时间的禁食以及营养不良与肝硬化相关。为了评估在疾病后期减少食物摄入量是否与患恶病质小鼠的肝硬化有关，我们开展了一项配对试验。这项研究中两组健康小鼠根据CT组和C26组进行配对饲喂，在限制饲喂组中小鼠的肝脏脂类和甘油三酯的升高比在对照组小鼠中观察到的症状明显减轻（图5D）。总之，配对饲喂试验不能够完全说明Pcyt1a和Chpt1表达的下降，上述两种酶对于O-胆碱磷脂转化为卵磷脂发挥作用（图5E）。上述试验表明患厌食症并不能驱动肝硬化过程和卵磷脂通路的下调。综上，我们可知肉毒碱的缺乏以及胆碱和O-胆碱磷脂转化为卵磷脂速度的降低是C26小鼠肝硬化的原因。
6. 肾脏的生酮作用在恶病质小鼠中发生了较大程度的上升并抵消了肝脏生酮作用的缺陷
酮体β-羟基丁酸在肝脏以及C26小鼠的门静脉和全身血液循环中发生了较大程度的上升（图2）。考虑到恶病质小鼠下降的食物摄入，这些变化是在预期之内的。但是，其他研究报道与健康的限制饲喂组的小鼠相比，恶病质小鼠中生酮反应下降。与后期的观察一致，我们注意到肝脏表达的Ppara（L2FC：-1.67，q <0.001），是调节肝脏生酮作用的转录因子，同时Hmgcs2（L2FC：-0.89，q < 0.001），为Ppara和生酮作用限速酶的靶标。根据Flint等的研究结果，在癌症恶病质过程重要的炎症过程中和后续IL6的增加都降低了PPARα活性和生酮作用。肝脏脂肪酸代谢的改变，与下降的β氧化过程一起，以及潜在的自噬作用的改变也参与了C26小鼠生酮响应的变化。在C26小鼠中生酮响应的变化通过在配对饲喂试验中测定β-羟基丁酸和Hmgcs2水平而得到确认。事实上，我们在肝脏β-羟基丁酸水平和限制饲喂动物的全身血液循环中（PF-C26）（图S4a和S4b）观察到相似的增加，这可以通过肝脏的生酮作用而进行解释（图S4c）。在代谢物组学和转录组学结果之间的矛盾，在增加β-羟基丁酸的水平同时降低了生酮物质转录本的水平，引导我们探索酮体生成的其他通路。肾脏的生酮作用也是有可能的，特别是在饥饿过程中。C26小鼠肾脏中Hmgcs2水平提高了14倍（图S4d）。该结果解释了在C26小鼠中观察到的β-羟基丁酸水平的上升。
7. 相似的肝脏变化在Lewis肺部肿瘤模型中被观察到
为了评估我们发现的意义，我们研究了相似的肝脏变化是否会在另一个癌症恶病质的模型中被发现，即在LLC模型中。相似的变化与G6pc有关，然而，正如在C26小鼠中，我们并未鉴别出Pck1表达量的变化（图S5a），表明该模型中也出现了糖质新生作用的下降。我们观察到肝脏氨基酸转运蛋白表达的显著增加（图S5b）。结合5倍以上的鼠类主要阳性APR的增加（图S5c），这些结果表明肝脏吸收的一种重要的氨基酸被用于了APR蛋白质的合成过程。正如在C26模型中，Cps1表达的下降（图S5d）违背了氨基酸在TCA循环中被利用的规律，与脂类代谢相关的变化证实了Rosa Caldwell的工作，我们也注意到了Bbox1，Pcyt1a，和Chpt1表达的下降（图S5e和S5f），这反映了肉毒素和卵磷脂合成的下降。虽然Hmgcs2的表达倾向于下降（30%下降，P = 0.13），我们观察到肝脏β-羟基丁酸水平在LLC小鼠中的上升（图S5g）。总之，这些结果拓展了我们在另一个癌症恶病质潜伏期模型中的发现。
8. 一些肠道微生物活性在癌症恶病质中下降
肠道微生物的组成在C26小鼠中的变化由两个不同的β多样性指数显示（图S6a和S6b）。这些变化，主要表现为硬壁门细菌的下降和变形细菌门的上升，也证实了我们之前的报道（图S6C）。为了鉴别产生特定代谢物的细菌，我们进行了代谢物和细菌ASVs之间的相关性分析，采用的是经典的偏最小二乘回归分析。经典的偏最小二乘回归是一种当变量数多于样本数时最大化两个数据集之间相关性的方法。它显示了特定ASVs对和代谢产物间特定的相关性（图6），通过此相关性我们可以聚焦一些相关性最强的靶标进行后续分析。ASV鉴别在表S5中被阐明。
9. 醋酸盐和丁酸盐，两种短链脂肪酸，在恶病质小鼠中下降
短链脂肪酸（SCFAs）主要通过肠道微生物菌群复杂碳水化合物的发酵产生，并且与宿主各种健康状况有关。我们的研究表明醋酸盐和丁酸盐，两种SCFAs，在恶病质小鼠盲肠内容物（CC）中下降，而丙酸盐和2-甲基丁酯酶保持不变（图2），琥珀酸盐降低了34%（q = 0.051）。SCFAs影响了结肠细胞的能量状态，肠道多肽的合成，血糖升高反应，血液和肝脏脂类含量，饱腹感，以及全身性炎症。由于细菌之间互养作用的发生主要来自于醋酸盐到丁酸盐的转化过程，这种互养可能证实了这两种代谢物的下降。丁酸盐和醋酸盐的下降与红霉菌和毛螺菌科家族成员细菌对应的ASVs下降相一致。值得注意的是，一种具有特别丰度的ASV（ASV2，被鉴定为红霉菌家族成员并代表了对照组小鼠肠道微生物菌群中约20%的细菌）在恶病质小鼠中下降了4倍的。有趣的是，两种不同的ASVs，以及ASV10和ASV16，被鉴定为肠杆菌科家族成员，与丁酸盐和醋酸盐的下降呈现负相关。这些结果有力的证实了我们2018年提出的一个机制，其中醋酸盐产生的下降，是由于丁酸盐生产者家族成员的下降而导致的（主要是毛螺菌科和红梅菌科），可通过肠道内糖酵解开关作用于C26小鼠的肠杆菌科细菌。丁酸盐被认为对于肠道健康和宿主代谢具有多种有益的效果。其中，已知丁酸盐可辅助支持肠道屏障的完整性，降低肠道炎症，并刺激胰高血糖素样多肽1的产生。肠道菌群中细菌组成的变化以及后续丁酸盐的下降能够参与我们在C26小鼠中报道的肠道屏障功能的变化。在C26小鼠盲肠组织中由丁酸盐调控的两个基因（Gcg编码高血糖素原，胰高血糖素样多肽1前体；Zfp148，一种醋酸盐诱导的锌指转录因子）表达的下降，有力的证明了丁酸盐下降影响了宿主代谢（图S7a和S7b）。为了克服与C26模型一致的肿瘤异位的局限性，我们也研究了这些标记在患恶病质白血病小鼠模型中的情况，并报道了肠道微生物组成的变化。有趣的是，这两种基因的表达在白血病小鼠近端结肠部位的表达也表现为下降（图S8a和S8b）。
10. 加速的肠道转运作用于氨基酸的细菌代谢并导致粪便中氨基酸的丧失
氨基酸在C26的盲肠内容物中也发生了显著的变化。大多数氨基酸在C26小鼠中表现出相当程度的上升（图2）。在此层次上14个鉴定出的氨基酸中，11个发生了显著的变化，天冬酰胺酸表现出上升的趋势，天冬酰胺无变化，谷氨酸盐在C26的盲肠内容物中显著下降。考虑到食物摄入的下降，这种大多数氨基酸上升并由此导致的恶病质小鼠中氨基酸吸收的下降是令人惊奇的。我们假设这种变化来自于加速的胃肠道转运。事实上，之前的工作报道了粪便氨基酸水平和转运时间在健康人体中呈现负相关。与该假设一致，我们观察到盲肠重量和胃内容物在恶病质小鼠中表现为显著下降（图7A和7B）。我们通过采用伊文斯兰（Evans Blue）染色的方法，发现肠道转运速度成倍的增加（图7C）。最终，我们也发现含水量增加不能解释粪便平均重量的增加，但该结果可通过增加的粪便蛋白质浓度增加而解释（图7D-7F）。一项最近在恶病质小鼠中进行的研究表明恶病质加速了胃部的清空。该研究证实了我们的发现，肠道活性在C26小鼠中受到影响并可能影响了蛋白质和氨基酸在胃肠道中的分解代谢。粪便蛋白质含量在癌症恶病质中通常不被报道。一篇文章涉及到患严重慢性心脏病和心脏恶病质病人粪便中的蛋白损失，而另一篇文章则报道了在患心脏恶病质的老年病人粪便中无蛋白质损失，而进一步的临床研究应评估蛋白质损失是否发生在患癌症恶病质的患者中。
转运时间的改变与肠道微生物组成有关。Roager等报道了蛋白来源和氨基酸来源的细菌代谢物与梭菌属细菌成员之间的正相关。我们观察到这种细菌在C26小鼠肠道内容物中梭菌属成员中显著下降。不仅如此，疣微菌科家族成员和一些红霉菌科成员都表现出与增加的氨基酸含量呈负相关的情况（图6）。采用Picrust2，一种预测细菌宏基因组的功能潜力的工具，我们观察到细菌谷氨酸盐通路的降解，谷氨酸在C26的肠道内容物中是唯一表现出下降的氨基酸（表S4）。我们发现4种相对丰度在1%到6%之间的C26小鼠的ASVs与盲肠谷氨酸盐水平表现出负相关（图6）（ASV8，属于毛螺菌科）并且是作用于C26小鼠谷氨酸盐降解通路中ASVs前10位的成员（PWY-5188和PWY-5918）。考虑到肠道微生物菌群组成加速转运及其变化，我们推测大多数氨基酸（除了谷氨酸盐）受到恶病质肠道微生物菌群代谢作用都较少，这影响了肠道健康。事实上，来自于芳香化氨基酸的代谢物（即：吲哚衍生物，对甲苯酚，以及乙酸苯酯）能够引发宿主的阳性或阴性反应。最近的研究显示4-对甲苯酚，一种肠道微生物来源的酪氨酸和苯基丙氨酸代谢物，可作为β细胞功能的有效调节因子；吲哚衍生物为色氨酸来源的代谢物，并且通过激活AhR通路激发了宿主多种有益的效果；反映AhR活性的Cyp1α1的表达，在C26小鼠的盲肠组织中表现出7倍的下降（图S7c），这种表达的下降在白血病小鼠中也被发现（图S8c）。该结果表明色氨酸在C26的盲肠内容物中的上升与色氨酸来源的细菌代谢物的下降一致，其对于肠道稳态维持的重要性最近被证实。值得注意的是，细菌和代谢物之间的关系是双向的。细菌能够产生一系列的代谢物，但是这些代谢物也可以反作用于细菌的生长。靶标试验表明硬壁菌门成员对于氨基酸敏感，这可通过添加氨基酸后这些细菌在体外生长速率的降低来反映。拟杆菌门成员对于氨基酸添加不敏感但是在缺乏SCFAs的介质中生长情况更好。这些体外试验结果对应于我们在C26小鼠中观察到的硬壁菌门细菌数量的下降、氨基酸含量的增加以及产生SCFAs（短链脂肪酸）较少的拟杆菌门细菌数量增加的趋势，表明改变的肠道菌群和代谢物组成在这种情况下具有相互影响。
11. 胆汁酸的改变和三甲胺-N-氧化通路的下降是C26小鼠的特征
在盲肠内容物中代谢物组学分析也指出了其他变化。虽然1H-NMR不能使个体的胆汁酸分化，我们观察到一个在C26盲肠内容物中胆汁酸的上升，也观察到小鼠中与胆汁酸共轭的牛磺酸4倍的增加（图2）。这种牛磺酸的增加可以通过转运的加速和/或者细菌代谢的下降进行解释，但这种增加也可能是由较低的肝脏对胆汁酸的结合能力所导致。后续的工作表明胆汁酸通路在癌症恶病质中发生了深刻的改变并作用于肝脏炎症。甲胺（即胆碱，肉毒碱以及卵磷脂）通过肠道微生物菌群被降解并且在肝脏的三甲胺N氧化（TMAO）过程中被转化，TMAO在心血管疾病中也发挥了重要作用。正如我们在C26小鼠中所观察到的，盲肠胆碱的增加结合PV和VC TMAO的下降（图2），我们得出结论：TMAO除了对心脏代谢变化的贡献外，TMAO通路在这些小鼠中表现为下降，这种降低可能通过降低细菌代谢和/或加速转运过程起到保护作用。
结论
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