科研 | Cancer Res.：SLFN11失活诱导蛋白毒性应激并使癌细胞对TAK-243增敏

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编译：微科盟李可爱，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

在大约50％的癌细胞系和大部分患者肿瘤样品中，我们发现了Schlafen11（SLFN11）蛋白失活导致的疾病化学抗药性，因此，需要新的治疗方法来靶向SLFN11缺失的癌症。经过前期研究，我们发现：TAK-243是一种临床开发的泛素激活酶UBA1抑制剂，可在SLFN11-KO细胞中激活细胞毒性，其作用机制与CHK1独立于ATR抑制claspin介导的DNA复制有关。我们通过进一步研究发现，SLFN11-KO细胞表现出了持续增强的蛋白泛素化、内质网（ER）应激、未折叠的蛋白应答（UPR）和蛋白聚集。TAK-243在SLFN11-KO细胞中比在WT细胞中更有效地抑制了蛋白的泛素化并激活了PERK，及磷酸化的eIF2alpha、IRE1和ATF6。生物素化质谱和RNAi筛选的蛋白质组学分析还显示SLFN11与翻译起始复合物和蛋白质折叠机制的物理和功能相互作用。这些发现揭示了SLFN11以前未知的功能，该功能可作为蛋白质质量控制的调节剂以及ER应激和UPR的衰减剂，而且，还暗示了TAK-243在SLFN11缺陷型肿瘤中的潜在价值。

论文ID

原名：SLFN11 inactivation induces proteotoxic stress and sensitizes cancer cells to ubiquitin activating enzyme inhibitor TAK-243译名：SLFN11失活诱导蛋白毒性应激并使癌细胞对泛素激活酶抑制剂TAK-243增敏
期刊：Cancer ResearchIF：9.725发表时间：2021.04通讯作者：Yves Pommier
通讯作者单位：美国国家癌症研究所

实验设计

TAK-243（初始名称为MLN7243）是泛素激活酶UBA1的抑制剂，可与游离泛素结合形成抑制UBA1的TAK-243-泛素加合物，损害细胞泛素结合，最终导致蛋白毒性应激并最终导致癌细胞死亡。本研究中，我们发现在临床前癌细胞系模型中，TAK-243在没有SLFN11的情况下，细胞毒性会更高。从病理机制上讲，我们发现TAK-243通过激活CHK1来响应ER应激和UPR，从而抑制DNA复制。我们发现了SLFN11的新功能，可作为蛋白毒性应激、过度泛素化、细胞蛋白聚集以及UPR激活的保护因子。本研究涉及流程如下：

实验结果

1. TAK-243在SLFN11缺陷型癌细胞中引起选择性细胞毒性
为了筛选及鉴定对SLFN11缺失细胞具有选择性治疗的化合物，我们在同基因白血病淋巴母细胞细胞系，CCRF-CEMSLFN11野生型（WT）和SLFN11敲除（KO）中进行了高通量药物筛选。不出所料，拓扑异构酶抑制剂（DNA破坏剂）在SLFN11-WT细胞中的细胞毒性比SLFN11-KO细胞更高（图1A），而TAK-243对SLFN11-KO细胞具有更大的细胞毒性（图1A）。为了确认TAK-243在SLFN11-KO细胞系中的选择性细胞毒性，我们测试了三种表达SLFN11及其同系物的同基因癌细胞对：前列腺癌DU145，肝细胞癌Li-7和白血病淋巴母细胞MOLT4。虽然先前已报道了DU145和MOLT4细胞系，但CRISPR/ CAS9产生了Li-7的SLFN11-KO细胞用于本研究，并被证实对CPT具有抗性。在所有三对细胞系中，SLFN11-KO细胞对TAK-243的敏感性与SLFN11-WT相似（图1B-D）。图1E总结了TAK-243对三对基因表达SLFN11和KO细胞系的活性差异。通过克隆形成试验证实了SLFN11-WT和KO细胞对TAK-243的敏感性差异。与WT细胞相比，SLFN11-KO细胞中的菌落形成在50nM的浓度下显着减少（p<0.05）（图1F）。图1 SLFN11缺乏细胞对TAK-243敏感
（A）用所示化合物筛选同基因性白血病淋巴母细胞CCRF-CEMSLFN11-WT和-KO细胞。D1：63.2nM，D2：189.6nM。（B-D）在指定的SLFN11-WT和-KO同基因细胞系中的TAK-243细胞毒性：前列腺癌DU145，肝细胞癌Li-7和白血病淋巴母细胞MOLT4。用所示浓度的TAK-243处理细胞72小时。（E）在图B-D中显示的不同细胞系中TAK-243的IC50值，显示了平均值SD和P值，并通过未配对的t检验确定了统计学显著性。（F）用所示浓度的TAK-243处理10天的DU145、SLFN11-WT和-KO细胞中的集落形成测定，菌落形成的图像被结晶紫染色。
与SLFN11-WT细胞相比，TAK-243还导致SLFN11-KO细胞中更多的细胞凋亡。此外，SLFN11-KO细胞中膜联蛋白V阴性和PI阳性人群增加，表明TAK-243引起了细胞凋亡。SLFN11-KO细胞中的凋亡细胞被证实为裂解的PARP和裂解的caspase-3增加。这些结果表明，TAK-243优先抑制SLFN11缺陷型癌细胞的细胞生存能力，这表明UBA1活性可促进SLFN11-KO细胞的存活。 2.TAK-243比SLFN11-WT细胞更有效地抑制SLFN11-KO细胞中的DNA合成
接下来，由于SLFN11已被很好地证明可抑制肿瘤细胞DNA复制，我们检查了TAK-243对细胞DNA复制的作用。我们首先在用TAK-243处理的SLFN11-WT和-KO细胞中进行胸苷类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）的脉冲掺入，以评估DNA合成。与SLFN11-WT细胞相比，SLFN11-KO中TAK-243在4小时内减少了EdU掺入（图2A-B）。在0.5µM TAK-243中，SLFN11-KO细胞中的EdU掺入被抑制了80％以上，而SLFN11-WT细胞中的EdU掺入被抑制了不到20％（图2A）。降低浓度的TAK-243，在24小时内被观察到EdU掺入减少。为了确认FACS结果，我们在EdU脉冲标记后进行了免疫荧光染色。在TAK-243处理后，SLFN11-KO细胞显示出EdU染色增强的丢失（图2C-D）。这些结果表明，TAK-243比SLFN11-WT细胞更有效地抑制SLFN11-KO细胞中的DNA合成。为了在分子水平上分析TAK-243对DNA复制的影响，我们使用分子梳测量了DNA的延伸和复制起点的激发。我们将SLFN11-WT和-KO细胞与氯脱氧尿苷（CIdU；红色）一起温育1小时，然后用TAK-243和碘脱氧尿苷（IdU；绿色）处理2小时（图2E）。IdU / CIdU的比值表示在不进行药物治疗的情况下的伸长速度，预期值为2（图2F），在用TAK-243处理的SLFN11-KO细胞中，IdU/ CldU比率显着降低，表明TAK-243在SLFN11-KO细胞中更有效地降低了复制的速度（图2E-F）。在相同的实验中，我们还分析了CIdU单色纤维与总测得纤维的比率，以估算新的起始点（图2G）。与SLFN11-WT细胞或未经处理的细胞相比，用TAK-243处理的SLFN11-KO细胞显示出的起始点激活明显更少。这些结果表明，TAK-243在SLFN11-KO细胞中最有效地中断了DNA的复制，无论是在延伸度还是起始位点。图2 TAK-243在SLFN11-KO中比在-WTDU145前列腺癌细胞中更有效地抑制DNA复制
（A）代表性的流式细胞术实验。将WT和KO细胞用指定的TAK-243浓度处理4小时，并在收获前最后30分钟添加EdU（10μM）。将WT和KO细胞用指定的TAK-243浓度处理4小时，并在收获前最后30分钟添加EdU（10μM）。FlowJo测量的复制（EdU和DAPI阳性）细胞的百分比显示在红色框中。（B）定量3次独立实验的EdU掺入，如小图A所示。误差线代表SD；** P = 0.002，***P <0.001。（C）通过共聚焦免疫荧光显微镜可视化的EdU掺入的代表性图像。WT和KO细胞用TAK-243（0.5μM）处理4小时，在最后30分钟内添加EdU（10μM）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。（D）通过免疫荧光分析定量在WT和KO细胞中EdU掺入，误差线代表SD（N= 250-300）。*** P ＜0.001。（E）通过分子梳试验分析的复制进展的抑制。上图：实验方案。WT和KO细胞与CldU（100μM）孵育1小时，然后加入TAK-243（0.5μM）和IdU（100μM）2小时。下图：DNA纤维的代表性图像。纤维的红色和绿色部分分别代表CldU和IdU的摄入量。（F）IdU/ CIdU的比率（绿色/红色）。各个纤维的绿色或红色部分的长度如图S2所示。红色条表示平均值（N≥198），*** P ＜0.001。（G）新的起源定义为在DNA梳理分析中测得的ldU单标记纤维。根据绿色信号的数量除以信号的总数（N= 177）计算百分比。误差线代表SD（N= 3个独立测量值）；** P = 0.003，***P <0.001。 3. TAK-243通过经由Claspin激活CHK1阻止DNA合成，但独立于SLFN11-KO细胞中的ATR
为了确定TAK-243如何抑制DNA复制，我们评估了DNA损伤反应（DDR）信号分子的磷酸化。在TAK-243诱导细胞DNA复制抑制的条件下，我们观察到SLFN11-KO细胞中CHK1的磷酸化增加（图3A和3B），还以较低的TAK-243浓度在10个小时的SLFN11-KO细胞中检测到CHK1过度磷酸化。值得注意的是，与用作阳性对照的CPT相反，TAK-243激活CHK1并没有RPA2和H2AX的磷酸化（图3A），这表明TAK-243诱导的CHK1激活独立于共济失调毛细血管扩张和RAD3相关（ATR）。我们证实，TAK-243不会诱导可检测的ATR激活，这与DDR有关，并且对CPT有反应（图3A，3C）。此外，鉴于CHK1通常被ATR激活，我们测试了ATR抑制剂对TAK-243激活CHK1的作用。与缺乏TAK-243激活ATR一致，ATR抑制剂M4344不能抑制TAK-243激活CHK1（图3D和3E），而在CPT情况下可以阻止ATR激活。这些数据表明，TAK-243激活CHK1独立于ATR，不同于CPT激活的经典RPA2-ATR-CHK1通路。由于Claspin是CHK1激活的介体，并且由于最近的一项研究表明thapsigargin（一种ER应激源）可以通过Claspin并独立于ATR诱导CHK1激活，因此我们假设TAK-243的CHK1激活可以由Claspin独立于ATR介导。为了验证这一假设，我们在TAK-243治疗之前使用小分子干扰RNA（siRNA）去除了内源性Claspin。SLFN11-KO细胞中Claspin的耗竭完全阻断了TAK-243对CHK1的磷酸化作用（图3F），与Claspin作为TAK-243激活CHK1的介体的作用一致。为了进一步检查这种可能性，我们测试了CHK1抑制作用是否可以恢复TAK-243处理的细胞中的DNA复制。用TAK-243和CHK1抑制剂处理的SLFN11-KO细胞比单独用TAK-243处理的SLFN11-KO细胞显示更高的EdU掺入（图3G-H），表明TAK-243的复制抑制作用是由TAK-243介导的CHK1激活。为了确定TAK-243激活CHK1是否会受到SLFN11缺陷细胞中SLFN11的重新表达的影响，我们使用了用SLFN11-WT表达构建体瞬时转染的293TSLFN11缺陷细胞。SLFN11缺陷细胞中SLFN11的重新表达抑制了TAK-243诱导的CHK1激活（图3I）。总之，这些结果表明，TAK-243通过独立于ATR的Claspin激活CHK1抑制DNA合成。图3 TAK-243独立于ATR，通过CHK1激活抑制DNA合成
（A）TAK-243处理后，通过蛋白质印迹法检测到的DNA损伤反应（DDR）蛋白。用TAK-243处理DU145SLFN11-WT和-KO细胞，用喜树碱（CPT100 nM）处理4小时的WT细胞作为阳性对照。（B，C）对3个独立实验的p-CHK1和p-ATR的定量，如小图A所示。** P = 0.003，***P <0.001。（D）TAK-243对CHK1的激活独立于ATR。在不存在或存在ATR抑制剂（M-4344;5 nM）的情况下，用TAK-243（1µM）将DU145SLFN11-KO细胞处理4小时。（E）对3个独立实验的p-CHK1进行定量，如小图D所示。误差线代表SD；* P = 0.042，**P = 0.002。（F）siClaspin抑制TAK-243激活CHK1。在TAK-243处理之前（0.5µM 4小时），用siClaspin转染DU145SLFN11-KO细胞48小时；（G）上半部分图显示：用于TAK-243和TAK-243处理的DU145SLFN11-KO细胞流式细胞术分析的实验方案。如图所示，在细胞收获前30分钟添加EdU（10μM）。下半部分图显示：通过流式细胞仪定量EdU和DAPI阳性细胞。如图2中确定复制的（EdU阳性）细胞的百分比（在红色矩形中指示）。（H）3个独立实验的EdU掺入的定量，如小图G所示。误差线代表SD；*P = 0.039，***P <0.001。（I）SLFN11抑制了TAK-243对CHK1的激活。如图所示，在TAK-243处理（0.5µM 4小时）之前，将SLFN11阴性293T细胞用SLFN11构建体转染48小时。 4.在缺乏SLFN11的细胞中，TAK-243可有效地诱导ER应激和UPR
已知TAK-243会诱导ER应激和UPR，并且已证明UPR可以激活CHK1并抑制DNA复制。另外，据报道，毒胡萝卜素或二硫苏糖醇激活PERK-eIF2途径可通过Claspin促进CHK1的磷酸化，而与ATR无关。为了测试SLFN11-KO细胞是否表现出增加的ER应激和UPR，我们在DU145WT和经TAK-243处理的SLFN11-KO细胞（图4B）中探查了与UPR相关的三个经典途径（图4A）。在用TAK-243处理的SLFN11-WT346细胞和-KO细胞中，磷酸化的PERK被检测为电泳上移的带。但是，SLFN11-KO细胞中磷酸化的eIF2α的基础水平更高，而SLFN11-KO中TAK-243的诱导比WT细胞更有效（图4B-C）。探测UPR的第二个IRE1-XBP1信号分支表明，在SLFN11-KO细胞中，IRE1的磷酸化速度比野生型细胞快。测试第三条UPR途径还显示，SLFN11-WT和KO细胞中的ATF6均增加。但是，ATF6的基线表达在SLFN11-KO细胞中更高。我们在处理2小时的白血病CCRF-CEM细胞以及在用较低TAK-243浓度处理24小时的DU145细胞和小细胞肺癌DMS114细胞中证实了这些结果，这些实验一起表明SLFN11-KO细胞在TAK-243的存在和不存在下均具有增强的UPR活化。为了检查TAK-243的CHK1（S345）的磷酸化是否依赖于PERK-ATF4分支的活化，我们用TAK-243和PERK抑制剂ISRIB处理了DU145SLFN11-KO细胞。ISRIB显着阻断了TAK-243对CHK1的磷酸化作用（图4D-E）。此外，与报道的TAK-243处理后包括c-Jun和c-Myc的短寿命蛋白积累一致，我们发现响应TAK-243的SLFN11-KO细胞中c-Jun和c-Myc的积累增加，表明用TAK-243处理的SLFN11-KO细胞具有更多的整体蛋白积累。因为p97抑制剂NMS-873和CB5083可以诱导强大的UPR，我们测试了药物在DU145SLFN11-WT和-KO细胞中的细胞毒性，SLFN11-KO细胞比WT细胞对两种p97抑制剂更敏感。因为我们的数据表明SLFN11-KO细胞表现出对TAK-243的增强的UPR反应，而TAK-243主要起E1抑制剂的作用，所以我们在SLFN11-WT和-KO细胞中测量了泛素结合物。值得注意的是，SLFN11-WT和-KO细胞中泛素结合物的总体基线水平是不同的，我们始终在DU145和CEMSLFN11-KO中观察到比SLFN11-WT细胞更高的泛素结合物[（Ub）n]（图4F），这表明缺乏SLFN11会增强整体泛素化。在TAK-243处理后，DU145SLFN11-KO细胞与SLFN11-WT细胞相比，以剂量依赖性方式破坏了泛素结合物，该作用与不同的UBE1蛋白水平无关。重复的实验（N= 6）证实SLFN11-KO细胞中的泛素结合物处于稳态，并且TAK-243在SLFN11-KO中的泛素结合物比WT细胞更稳定地降低（图4G）。我们在用TAK-243处理1小时的CCRF-CEMSLFN11-WT和-KO细胞中以及在用较低浓度的TAK-243处理24小时的DU145SLFN11-WT和-KO细胞中获得了可比的结果。这些结果表明，在不存在SLFN11的情况下，TAK-243可以更有效地消耗泛素结合物。为了确认SLFN11的存在影响稳态条件下的全局泛素化，我们生成了强力霉素（Dox）来诱导SLFN11表达细胞。暴露于Dox的72小时诱导了SLFN11的强表达，并显着降低了40-50％（图4H-1）。总之，这些结果表明，缺乏SLFN11的细胞具有增加的UPR和泛素化作用，与SLFN11-WT细胞相比，TAK-243在SLFN11-KO中抑制泛素结合物并增加CHPR激活的UPR和ER应力。图4 SLFN11 KO细胞具有较高的泛素化水平，而TAK-243进一步减少了泛素结合物并在这些细胞中引发了ER应激介导的UPR
（A）蛋白质反应（UPR）的方案流程。ERAD：ER相关的错误折叠蛋白的降解。（B）如图所示，在DU145WT和SLFN11-KO细胞中通过蛋白质印迹法测量了由TAK-243（0.5μM）引起的UPR应答的激活。用CPT（100nM，持续4小时）处理的WT细胞作为对照。（C）对3个独立实验的p-eIF2定量，如B组所示。（D）通过结合TAK-243和PERK-ATF4抑制剂使eIF2磷酸化。用TAK-243（0.5μM）处理细胞持续4小时，然后在TAK-243之前1小时加入PERK-ATF4抑制剂（ISRIB;10μM）。（E）对3个独立实验的p-CHK1进行定量，如D组所示。（F）通过蛋白质印迹法测定的泛素结合物[（Ub）n]。用指示的TAK-243浓度处理DU145细胞1小时。红色矩形表示在图G中量化的面积。（G）TAK-243处理1小时后总泛素结合物的定量。误差线代表SD（N= 6）；* P = 0.031，***P <0.001。（H）基底泛素结合物[（Ub）n]在强力霉素（Dox）诱导的SLFN11表达细胞中的变化。将细胞用Dox10μg/ ml处理指定的时间。红色矩形表示在图I中量化的面积。（I）Dox处理后总泛素结合物的定量。误差线代表SD（N= 2）；** P = 0.002，***P <0.001。 5. SLFN11通过与蛋白质折叠和翻译起始复合物相互作用来保护细胞免受UPR侵害
为了测试SLFN11的缺失是否会导致错误折叠的蛋白质积累，我们分别通过PROTEOSTAT染色和L-高炔丙基甘氨酸（HPG）标记评估了聚集的蛋白质和新合成的蛋白质（图5A）。在稳态条件下，SLFN11WT细胞显示出比KO细胞少的聚集蛋白，而TAK-243在WT和KO细胞中均增加了聚集蛋白（图5B-C）。另外，Li-7SLFN11 WT细胞中的新合成蛋白质少于KO细胞，这些数据表明SLFN11可以在稳态条件下减少聚集的蛋白质和/或新合成的蛋白质，这与表达SLFN11的细胞中泛素结合物水平较低相符。接下来，为了确定SLFN11是否与蛋白质稳态和UPR途径相互作用，我们用生物素化质谱法进行了蛋白质组学分析（图5D），用接近依赖性生物素鉴定（BioID）2-融合空载体或BioID2-融合SLFN11转染HEK293SLFN11-WT的细胞。加入生物素后，紧靠SLFN11的蛋白质在细胞内被生物素化。我们通过链霉亲和素珠捕获生物素化的蛋白质，质谱分析显示了在SLFN11-BioID转染的细胞中鉴定出属于T复合蛋白-1环复合物（TRiC）和含有伴侣蛋白的TCP-1复合物（CCT）TCP1、CCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6A、CCT7和CCT8。此外，翻译起始复合蛋白（EIF3A，EIF3B，EIF3D，EIF3E，EIF3F，FIF3H，EIF3L，EIF3M，EIF4B和EIF4G1）也富含SLFN11-BioID转染的细胞。在生物素化质谱蛋白质列表中排名前100位的基因本体论（GO）术语富集分析显示，翻译起始和蛋白质折叠相关途径是SLFN11的重要蛋白质网络（图5F）。为了验证质谱数据，我们对SLFN11-HA-BioID2构建体进行了实验，并证实了SLFN11介导的免疫沉淀中EIF3B，EIF3L和CCT2的富集（图5G）。无论TAK-243处理如何，均检测到SLFN11与EIF3B和CCT2的相互作用（图5G）。我们还通过DU145细胞中的邻近连接技术（PLA）验证了SLFN11与EIF3B和CCT2的相互作用（图5H-I）。TRiC/ CCT伴侣蛋白基因（CCT6A，CCT4，TCP1，CCT7，CCT3和CCT2）的耗竭始终显示SLFN11-KO比SLFN11-WT细胞具有更高的敏感性。另外的实验证实，SLFN11-KO细胞比SLFN11-WT细胞对CCT2的依赖性更大。图5  SLFN11与翻译起始和蛋白质折叠复合物的相互作用
（A）PROTEOSTAT聚集蛋白检测测定的方案。（B）通过流式细胞术测量在具有或不具有TAK-243的DU145SLFN11-WT和KO细胞中的聚集蛋白的代表性图像（50nM，24小时）。（C）如B组所示的聚集蛋白的定量。误差线代表SD（N= 5）；* P = 0.013，**P = 0.002，***P <0.001。（D）生物素化质谱分析和免疫印迹方案的示意图。（E）通过STRING分析产生的SLFN11的蛋白质相互作用网络。线宽代表数据置信度的强度。（F）与SLFN11相关的分子网络的基因本体论（GO）分析。（G）验证与EIF3B和CCT2的相互作用。用图S5E中使用的SLFN11载体转染细胞。在收获细胞之前，将TAK-243（0.5μM）加入4小时。用链霉亲和素免疫沉淀后，用所示抗体进行免疫印迹。（H）在DU145细胞中SLFN11与EIF3B和CCT2相互作用的邻近连接测定法。红点表示蛋白质相互作用。图像由ZeissLSM 780 ELYRA（63倍放大率）捕获，并由ImageJ软件修改。（I）通过ImageJ软件（N＞100）定量PLA强度，如图H所示。*** P <0.001（t检验）。
总的来说，这些结果表明SLFN11在促进蛋白质稳态和减少由错误蛋白质折叠引起的细胞泛素化中起作用。

讨论

蛋白酶体的泛素结合和内质网应激相关的蛋白质降解（ERAD），这些对于从内质网逆向转运后错误折叠的蛋白质的清除至关重要。通过阻断泛素激活酶（UBA1），TAK-243诱导了无法解决的ER应激和UPR激活。我们的数据与TAK-243在抑制泛素结合中的强效和快速作用是一致的，正如细胞多聚泛素化蛋白（特别是SLFN11-KO癌细胞）的快速耗竭所显示的那样。我们的研究还表明，由TAK-243激活的UPR通过激活CHK1，在2-4小时内阻止复制并诱导凋亡和细胞死亡。因此，我们的数据支持TAK-243的作用机理及其在SLFN11-KO癌细胞中的优先抗增殖作用，这种结果与TAK-243在患者来源的异种移植（PDx）模型中报道的活性有关。我们的流式细胞仪，免疫荧光显微镜和分子梳理分析表明，TAK-243除了靶向UPR外，还在2-4小时内中断了复制性DNA的合成，因为它消耗了细胞内的泛素化作用。我们证明了这种复制抑制与通过Claspin的CHK1激活有关，但没有检测到ATR介导的DDR激活（图6）。与我们的结果一致，两项先前的研究报告说，TAK-243本身不会引起DNA损伤，并且TAK-243与紫外线或伽马射线的结合会抑制DNA损伤的修复。在我们的研究中，缺乏TAK-243诱导的H2AX与以前的报道相吻合，以前的报道表明，用TAK-243治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞产生H2AX。我们的解释是，在先前的研究中，TAK-243诱导H2AX与细胞凋亡引起的细胞死亡有关，因为H2AX既是DDR的标志物，又是凋亡反应的标志物。我们发现TAK-243通过激活CHK1阻止DNA复制与报告一致，显示ER应激和不受控制的UPR引起非ATR介导的CHK1激活。一个出乎意料的发现是SLFN11衰减了UPR（图6），在两种不同的等基因细胞系模型（DU145前列腺癌和CCRF-CEM白血病）中，表达SLFN11的细胞在稳态下显示出明显较低的全局多泛素化水平，同时具有减弱的UPR活性基线和减少的蛋白质聚集。由于我们观察到SLFN11与蛋白质折叠和翻译起始因子的结合，因此我们的蛋白质组学分析为SLFN11的这种新型蛋白鉴定提供了分子见解。全基因组RNAi筛选对基因依赖性进行分析也支持SLFN11缺陷细胞高度依赖蛋白伴侣蛋白和折叠基因，表明缺乏SLFN11会导致蛋白错误折叠和对细胞泛素化的依赖，而TAK-243会抑制这种作用（图6）。图6 SLFN11介导的蛋白质质量控制模型以及与TAK-243的关联
SLFN11与蛋白质伴侣蛋白TRiC/ CCT复合物和翻译起始复合物相互作用，并减少蛋白质错误折叠。TAK-243阻止泛素化，促进错误折叠的蛋白质积累，并引起内质网应激和不受控制的UPR。在没有SLFN11的情况下，错误折叠的蛋白质会积聚，从而导致蛋白质泛素化、ER应激激活和UPR。TAK-243诱导的UPR过度激活通过Claspin诱导CHK1激活。
与SLFN11的翻译活性一致，SLFN11已被证明与II型tRNA结合，导致其可作为HIV-1的限制因子，并裂解II型tRNA，从而响应DNA损伤而导致ATR和ATM抑制；还报道了SLFN11通过靶向宿主tRNA来限制病毒的感染性，tRNA的结合和切割也已被SLFN13证实。非人灵长类动物SLFN11还抑制病毒，非病毒和宿主转录本的蛋白质产生。此外，最近的一项研究表明SLFN11通过抑制RPS4X和mTOR途径来抑制肿瘤的生长和转移。我们的研究也是第一个报告SLFN11可能与蛋白折叠有关的研究。鼠Slfn1与DnaJ/ Hsp（热激蛋白）家族的一种伴侣蛋白DnaJB6结合，从而导致Hsp70的稳定化在蛋白质折叠和蛋白质质量中起重要作用。这种复合物导致Slfn1定位于细胞核，并诱导细胞周期停滞和鼠T细胞的静止。另外的报告显示，Slfn2的突变导致小鼠免疫细胞的静止丧失和慢性ER应激，有必要进行进一步的研究，以探索SLFN11蛋白稳定、内质网应激及UPR控制之间的具体分子联系。除癌症外，人类细胞中不受控制的内质网应激还可以诱发多种疾病，例如动脉粥样硬化，糖尿病和神经退行性疾病，包括阿尔茨海默氏病和帕金森氏病。此外，伴侣蛋白TRiC/ CCT已被检测为保护细胞免受淀粉样蛋白错误折叠的关键分子。我们的质谱分析表明TCP1和CCT是SLFN11相互作用中间体。最近，详细的免疫组织化学和RNA表达研究表明，SLFN11在正常人脑细胞和其他有机细胞中表达。我们的结果表明缺乏SLFN11的细胞高度依赖CCT基因，这暗示着在缺乏SLFN11的情况下蛋白质折叠过程中的异常。综上所述，这些数据表明SLFN11可能参与保护正常人细胞，特别是大脑和免疫细胞免受蛋白毒性，并且SLFN11的功能失常可能与包括神经退行性疾病和自身免疫性疾病在内的多种人类疾病有关。我们的发现可能与TAK-243的治疗发展有关，其中包括SLFN11表达作为癌症患者选择的治疗反应预测生物标志物。大约50％的癌细胞不表达SLFN11，因此TAK-243对于SLFN11缺乏且对DNA损伤剂无反应的癌症患者可能是一种治疗选择。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33863777/

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