科研 | Mol Brain：基于iTRAQ的蛋白质组学分析揭示甲状腺素用于治疗创伤性脑损伤的新证据

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编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读创伤性脑损伤（TBI）是全世界致残和死亡的主要原因。以往，RNA分析被广泛用于研究TBI的病理生理机制，但由于转录组与蛋白质组的相关性较低，RNA转录丰度不能可靠地预测蛋白质丰度，导致了蛋白质组学研究的出现。在这项研究中，iTRAQ蛋白质组学方法被应用于大规模检测TBI后的蛋白质变化。研究共鉴定出3937个蛋白，其中146个蛋白在TBI后发生显著变化。此外，平行反应监测（PRM）证实了23个上调蛋白，16个蛋白的折叠变化与iTRAQ结果一致。转甲状腺素（Transthyretin，Ttr）在转录水平上调已被证实，本研究在蛋白质水平进一步证实了这一点。我们采用Ttr转运的甲状腺素(T4)治疗后，观察T4对神经元组织病理学和行为表现的影响(TBI + T4组)。结果发现脑水肿减轻，血脑屏障完整性改善，与对照组，T4治疗组的Morris水迷宫试验（MWM）逃避潜伏期明显下降。与TBI+生理盐水组相比，TBI+T4组的改良神经系统严重程度评分（mNSS）在TBI后第1天至第7天下降。这些结果表明，T4治疗有可能减轻TBI后的病理和行为异常。我们用iTRAQ蛋白质组学检测T4治疗后的蛋白质变化，T4治疗可逆转TBI后Lgals3、Gfap和Apoe等蛋白的上调。GO富集显示T4主要影响中间丝组织、胆固醇转运和轴突再生。总之，iTRAQ蛋白质组学提供了有关TBI对蛋白质改变影响的信息，并深入了解了TBI和T4治疗的潜在机制和途径。最后，Ttr和iTRAQ鉴定的其他蛋白可能成为TBI后新的治疗靶点。

论文ID

原名：iTRAQ-based proteomic profiling reveals protein alterations after traumatic brain injury and supports thyroxine as a potential treatment译名：基于iTRAQ的蛋白质组学分析揭示了创伤性脑损伤后的蛋白质改变，并支持甲状腺素作为一种潜在的治疗方法
期刊：Molecular Brain
IF：4.868发表时间：2021.01通讯作者：赵剡，马浩力
通讯作者单位：武汉大学中南医院

实验设计

实验结果

1. 差异表达蛋白的iTRAQ分析
我们从两组中分离出八个大脑皮质样本，并使用iTRAQ标记和LC-MS/MS进行分析（图1）。我们采用主成分分析（PCA）以比较TBI组和sham组之间的蛋白质组，并且观察到样本组具有良好的聚集性（图1a）。基于结果分析，我们共鉴定和量化了3937个蛋白质，其中125个蛋白质上调，21个蛋白质显著下调（倍数变化>1.20和<5/6，p<0.05为阈值；图1b；表1）。根据折叠变化排名前五位的蛋白质包括Hspa4、Alb、Hba1、Hbb和Krt42；根据p值排名前五位的蛋白质包括Krt10、S100a8、Mug1、Hpx和Gc（图1c）。层次聚类分析（热图）用于显示样本和组之间的差异蛋白质模式。如图1d所示，两组显示出不同的蛋白质变化模式，并且一组中的大多数样品一致地上调或下调，表明了良好的再现性。附加文件1：表S1显示了iTRAQ鉴定的所有蛋白质和差异表达蛋白质的原始数据。表1 iTRAQ检测脑外伤后差异表达蛋白 图1 一般蛋白质组学结果
a 主成分分析表明TBI（蓝色）和sham（黄色）组的蛋白质几乎完全分离。b 125蛋白表达上调，21个蛋白表达下调。c 火山图显示差异表达蛋白。红点和绿点分别表示显著上调和下调的蛋白质。d 层次聚类分析。红色表示上调，绿色表示下调。 2. GO分析
通过GO富集分析，我们对不同蛋白质中的生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）进行了富集注释。如图2a所示，大多数过度表达的生物过程与内肽酶、水解酶和肽酶的调节以及催化活性和蛋白质水解的负调节有关。在CC注释中，高度富集的术语包括细胞外区域、细胞外空间、血液微粒、细胞外小泡、细胞外器和细胞外泌体（图2b）。由此可以推断，大多数差异表达的蛋白质是细胞外的，包括Ttr，分子功能注释与BP一致，包括对内肽酶和肽酶等酶的抑制。一些蛋白质还与蛋白质结合（即Ttr和Camk2g）和氧结合（即Alb、Hbb和Hba1；图2c）有关。 图2 TBI和sham大鼠差异表达蛋白的生物信息学分析
a 生物过程。b 细胞成分（CC）。c 分子功能。颜色越深表示统计意义越大。d 气泡图显示差异基因的KEGG分析。气泡大小表示每个通路中包含的蛋白质的数量，不同的颜色表示不同的p值。e 蛋白质-蛋白质相互作用。 3. KEGG分析
为了揭示TBI组和sham组间差异表达蛋白的相关通路，我们采用KEGG通路分析。如图2d所示，最显著富集的途径和最高富集因子是非洲锥虫病。血红蛋白相关蛋白如Hbb、Hba1、Hba-a3和ApoA1在该途径中富集。疟疾途径类似于非洲锥虫病，因为与该途径相关的蛋白质也都来源于血液。可卡因成瘾、安非他明成瘾和多巴胺能突触也是重要的途径，并共享与多巴胺合成相关的蛋白，如蛋白磷酸酶1调节亚基1B（Ppp1r1b）、酪氨酸羟化酶（Th）和多巴脱羧酶（Ddc），除了钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ型亚单位γ（Camk2g）之外，Camk2g被认为是记忆的介质，在记忆不稳定中起重要作用。KEGG分析中富集分值前20位的通路包括胃酸分泌、心肌细胞肾上腺素信号、矿物质吸收、近端小管重碳酸盐重吸收、心肌收缩、补体和凝血级联反应、胰岛素分泌、胰腺分泌、阿米巴病、酪氨酸代谢、cAMP信号通路、醛固酮调节的钠重吸收、碳水化合物消化吸收、内分泌等因子调节的钙重吸收、金黄色葡萄球菌感染等。 4. 蛋白质相互作用分析
为了进一步了解改变蛋白之间的相互作用，我们进行了生物信息学分析（本例中为PPI）。根据图2e，上调蛋白（Ppp1r1b、Th和Ddc）和一种下调蛋白（Camk2g）与可卡因成瘾和安非他明成瘾途径更相关。有趣的是，与心肌相关途径和胃酸分泌途径相关的蛋白质均下调（即Atp1a2、Atp1a1、Camk2g、Kcnj10和Cacng3）如图2e所示，我们鉴定了以下蛋白质：Ttr与Tf（血清转铁蛋白）、ApoA1、Hp（结合珠蛋白）、Itih4（α-胰蛋白酶抑制剂重链4）、Afm（afamin）和溶菌酶C-1相互作用。Ambp（α-1-微球蛋白/比库宁前体）与A1m（α-1-微球蛋白）、Hpx（血凝素）、Gc（Gc维生素D结合蛋白）、Ahsg（α2-HS糖蛋白）、ApoA1、Apoh、Itih4、Itih2、Afm、C9和Orm1（类口腔粘液1）相互作用。Th与Ddc、Pcbd1（pterin-4α-甲醇胺脱水酶）、Pcbd2、Calb2（calbindin2）、Penk（前脑啡肽）和Hbb相互作用。Hspb1（热休克蛋白b1）与Hspa4、Anxa1（膜联蛋白A1）和Cck（胆囊收缩素）相互作用。 5. PRM对差异表达蛋白的验证
PRM分析用于验证先前通过定量iTRAQ分析鉴定的23种上调蛋白的丰度变化。如表2所示，在23种蛋白质中，有7种与定量分析得出的结果不一致。其中F1LRV4（Hspa4）和Q6IFU7（Krt42）无明显变化，而Q6IFV1、Q6IMF3、Q6P6Q2、D3ZJF8和G3V9R9（Krt14、Krt1、Krt5、Fcgbp和Afamin）表达下调。其他16种蛋白质与先前的iTRAQ分析结果一致，其中11种显示在图3a中。附加文件2：表S2显示了所有肽和蛋白质的详细定量。Ttr中两个肽的强度和峰面积如图3b所示。每个样品中两个肽的准确强度和峰面积如附加文件3：图S1和附加文件4：图S2所示。CCI后Ttr强度显著升高，与iTRAQ分析一致。 图3 平行反应监测结果
a iTRAQ法与PRM法对某些蛋白质折叠变化的比较。折叠变化>1表示上调。b 每组四个样品的两个Ttr肽的保留时间和强度（上）。 表2 用PRM验证TBI后差异表达蛋白 
6. T4治疗后的组织病理学
为了评估T4对减轻TBI引起的脑血管组织病理学的影响，我们检查了脑含水量和BBB完整性（图1）。首先，我们检测四组（sham+生理盐水组、sham+T4组、TBI+生理盐水组和TBI+T4组）的脑损伤体积，发现T4组明显缩小了TBI大鼠的损伤体积，如图4a所示的脑切片所示，TBI+生理盐水组的病灶体积明显高于sham+生理盐水组（1.90 ±0.21比13.20±2.34 mm³，p=0.0011）。比较TBI+T4组的病灶体积时，差异也很显著（13.20±2.34 6比.12±1.69，p=0.013）。脑含水量用湿-干比法测定。根据图4b，两个sham组（暴露或未暴露于T4[78.03±0.26%比78.78±0.67%，p=0.14]）之间的含水量没有变化，而在CCI后未暴露于T4的同侧大脑半球的含水量显著增加（78.03±0.26%比80.90±0.37%，p=0.0085）。CCI大鼠暴露于T4后，其含水量显著降低（79.46±0.25%，p=0.0049），但仍显著高于sham+生理盐水组（p=0.0024），暗示添加T4可改善脑水肿。我们检查了EB染料的渗出情况，如图4c所示，CCI后24小时，TBI+生理盐水组的渗出明显增加（76.16±10.19μg/g比164.30±9.44μg/g，p=0.0004）。TBI+T4组的渗出率也明显低于TBI+生理盐水组（110.30±13.62μg/g，p=0.0049），但也高于sham+生理盐水组（p=0.025），这表明暴露于T4后BBB的完整性得到改善，大脑样本也证实了这些结果。总的来说，上述结果表明T4减轻了TBI引起的脑组织病理学改变，包括BBB损伤和脑水肿。 图4 T4对TBI后组织病理学的影响
a 左侧显示甲酚紫染色的脑切片。根据切片计算病变体积（n=3/组）。b 创伤性脑半球的脑含水量在TBI后1天增加，而T4可减轻水肿（每组n=3）。c 通过检测EB染色液的渗出来反映c-BBB的完整性。 7. 行为结果
为了研究T4对改善CCI后大鼠行为表现和神经功能的影响，我们进行了mNSS和MWM试验（图1）。如图5a所示，在CCI后第1、3、5和7天，TBI+生理盐水组的mNSS显著高于sham+生理盐水组（所有组均p<0.0001）。第1天和第3天，TBI+T4组的mNSS也显著高于sham+生理盐水组（第1天p=0.0002，第3天p=0.026）；然而，在第5天，两组之间的差异不显著（p=0.14）。此外，TBI+生理盐水组和TBI+T4组在所有四天内均存在显著差异（第1天p=0.011，第3天、第5天和第7天p<0.01）。MWM测试在第7天开始时进行（图5b）。第7天，四组间的逃逸潜伏期差异不显著。第8天后，TBI+T4组的逃逸潜伏期逐渐下降，TBI+生理盐水组的逃逸潜伏期维持在高于sham+生理盐水组的水平（第8天p=0.0020，第9天p=0.0090，第10天p=0.0120，第11天p<0.0001）。第10天之后，TBI+生理盐水组和TBI+T4组之间存在显著差异（第10天p=0.0098，第11天p=0.030）。试验第12天，TBI+生理盐水组的逃逸潜伏期显著高于sham+生理盐水组（92.00±36.39 比16.18±13.46，p=0.0007）。经T4治疗后，逃逸潜伏期显著下降（35.30±21.85，p=0.0084）。在CCI后第12天，我们测试老鼠穿过区域（平台之前放置的位置）的次数。如图5d所示，TBI+生理盐水组的大鼠与sham+生理盐水组的交叉频率较低（0.67±0.82 vs. 2.00±0.63 p=0.010），TBI+T4组的交叉频率高于TBI+生理盐水组（1.667±0.82 p=0.060）。我们还测量了测试日在平台区域中花费的时间（图5e），TBI+生理盐水组在象限的时间明显少于sham+生理盐水组（21.15±6.16比 34.65±11.15，p=0.027）和TBI+T4组（33.42±3.706，p=0.0019）。此外，TBI+生理盐水组和sham+生理盐水组在试验日的逃逸潜伏期也存在显著差异（p=0.0007），T4对行为结果改善的作用是明显的。 图5 行为结果
a 在TBI后第1天、第3天、第5天和第7天进行mNSS评分（每组n=6）。b MWM试验中TBI后7～11天的逃避潜伏期。在试验第12天，检测c逃逸潜伏期、d跨平台次数和e平台象限时间。 8. T4处理后的蛋白质组学分析
我们还对CCI和T4治疗后的皮质进行了iTRAQ分析，通过全蛋白质组学分析，确定了一系列可能参与T4效应的蛋白质和途径。sham+生理盐水组和TBI+生理盐水组共检测到199个差异表达蛋白，TBI+生理盐水组和TBI+T4组共检测到51个差异表达蛋白。在这些差异蛋白质中，有23种蛋白质通过TBI改变，并通过T4处理逆转（附加文件1：表S1；图6a，b）。一些蛋白质如Lgals3、Hspb1、Vim、Gfap、Fabp7、Pltp、Msn、Ctsb和Apoe在TBI后上调，并在T4处理后逆转，Abca1、Clpp、Mtco1、Nefm和Nefl等蛋白质的表达趋势在T4处理后显著改变（图7c）。大多数逆转蛋白在TBI后上调，T4下调（图6c）。经T4处理改变的51个蛋白质被富集为GO术语。图6d显示了前10个GO术语和与这些术语相关的基因，差异蛋白主要与中间丝组织、胆固醇运输和轴突再生有关。图6 行为结果
TBI 后第1、3、5 和7天的mNSS评分（每组n=6）。b TBI 后 7 至 11 天的 MWM 测试中的逃逸潜伏期（每组n =6）。在测试日（第12天），检测到c 逃逸潜伏期、d 平台穿越次数和 e 在平台象限中花费的时间。
图7 TBI和T4治疗后的蛋白质组学分析和GO富集
a 文氏图显示，TBI与sham和TBI+T4与TBI在差异表达蛋白中有重叠。b 热图显示，经T4处理后，51种蛋白质发生了显著变化。色标中的数字表示z分数。c 经T4治疗后蛋白质有明显改变。d 前10个GO术语和与这些术语相关的蛋白质。

讨论

定量蛋白质组学已广泛应用于许多疾病模型（包括TBI）中差异蛋白和途径的检测。在这项研究中，一个8-plexiTRAQ蛋白质组学分析能够研究大规模的蛋白质改变。我们总共鉴定出3937个蛋白，其中差异表达蛋白146个；其中一些蛋白质已被发现与创伤性脑损伤有关。cAMP信号通路相关蛋白鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G (Gnal)和磷酸二酯酶10A (Pde10a)在本研究中显著上调。KEGG也显示cAMP信号通路具有显著性，这与Song等人之前的研究一致。本研究进一步证实了cAMP信号通路与TBI的关系。最近，许多研究已经证明Hsp70在包括人在内的哺乳动物的创伤性脑中迅速增加，并且对脑康复具有保护作用，这种现象也反映在蛋白质组学结果中，尽管PRM没有显着增加。此外，Hspb1在iTRAQ和PRM中均上调，这与脊髓多发性硬化有关。热休克蛋白家族中的许多蛋白质已被发现对神经退行性疾病和脑外伤具有保护作用;因此，需要进一步研究该家族其他蛋白在创伤后保护中的作用。PRM和iTRAQ之间也存在不一致，例如，Hsp70在iTRAQ中上调8倍，而在PRM中没有显著变化。在蛋白质组学分析中，假阳性是可能的，因为蛋白质的定性分析是根据匹配程度和多肽的数量来评分的，所以结果总是有可能的。同时，Hsp70具有同源蛋白，影响了鉴定的准确性。因此，需要像PRM这样的验证。S100钙结合蛋白A9 (S100A9)上调被认为与急性神经炎症有关，这与本研究的蛋白质组学结果一致。此外，最近的一项研究表明，S100A9基因缺失具有神经保护作用，这表明S100A9可能是脑外伤的潜在治疗靶点。Hpx还能保护脑缺血时血脑屏障的完整性。Gc是一种结合蛋白，运输维生素D，维生素D水平与颅脑损伤严重程度显著相关，创伤后补充维生素D可能是有益的。Penk是内源性阿片系统中的一种蛋白质，可能有助于预测严重创伤性脑损伤的临床结果，它已被用于缓解创伤性脑损伤大鼠模型的颅面疼痛。KEGG结果反映了可卡因成瘾与TBI的关系。之前的一些研究也得出了类似的结论。有可卡因成瘾的个体被发现有TBI史的比例高于健康个体。TBI被提出是为了增强某些心理刺激的奖励效应，并与药物滥用的脆弱性增加有关。药物成瘾与多巴胺有关，多巴胺是一种控制动机和兴奋的神经递质。KEGG分析还发现，一些上调的蛋白参与了多巴胺能突触活性，该通路中的一些蛋白(如Camk2g、Ppp1r1b、Th和Ddc)也参与了可卡因或安非他明成瘾通路。这些结果证实了先前的研究发现，脑外伤可能通过多巴胺突触通路增强药物成瘾。有趣的是，心肌细胞中的肾上腺素能信号和心肌收缩与TBI有关。既往研究表明创伤性脑损伤后心脑之间存在相互作用，创伤性脑损伤可能是心肌功能障碍的危险因素。甲状腺激素已被证明对脑损伤后的神经元保护、恢复和再生至关重要，并被认为是一种潜在的治疗方法。Ttr是甲状腺激素的主要载体，可以穿过血脑屏障，优先与T4结合，iTRAQ分析显示Ttr在创伤性脑损伤后上调，并进一步采用PRM验证。最近，使用无偏单细胞测序，Arneson等人证明创伤性脑损伤后海马组织中不同细胞类型的Ttr上调和T4调节Ttr可减轻小鼠TBI引起的行为结果和遗传问题。研究得出结论，TBI后Ttr的上调是由于大脑中缺乏甲状腺激素，T4可能逆转这种缺陷。T4处理可以逆转许多T4转运蛋白基因的表达模式，其中Ttr显示最显着的倍数变化。我们的研究证实，使用T4可以改善脑水肿，改善BBB的完整性，并改善受TBI影响的大鼠的认知结果。一些影响源于甲状腺素本身的生理功能，而某些影响可通过调节Ttr来实现。另一项研究也证实，Ttr随着TBI严重程度的增加而增加；因此，Ttr可用作评估TBI严重程度的标准。定量蛋白质组学进一步证实了Ttr在TBI中的重要作用。TBI和TBI + T4之间的蛋白质组学分析揭示了T4治疗的途径。T4处理后有51个蛋白差异表达，其中23个蛋白逆转了TBI后的变化。在这23种蛋白质中，许多已经被研究并证明与神经炎症、脑水肿和血脑屏障完整性有关。例如，Galectin-3 (Lgals3)在神经退行性疾病的脑炎症反应中起重要作用，抑制Galectin-3已被证实可改善蛛网膜下腔出血的脑水肿。Hspb1 (Hsp27)对应激反应有一定的神经保护作用。当激活Hsp27时可改善颅内出血继发性脑损伤，减轻血脑屏障破坏。波形蛋白(Vimentin)和GFAP是参与神经可塑性和再生的中间丝，在损伤、缺血和神经退行性变等应激反应中发挥重要作用。GFAP也被证实是TBI诊断和预测的敏感生物标志物，这与我们的蛋白质组学结果一致。星形胶质细胞脂肪酸结合蛋白-7 (Fabp7)与胶质细胞分化、增殖和神经发生有关，并已被证实可保护脑外伤后血脑屏障的完整性。磷脂转运蛋白(PLTP)和moesin已被证实通过参与脑血管重构和维持血脑屏障转运蛋白的功能，对血脑屏障的完整性具有保护作用。ATP结合盒转运体成员A1 (ABCA1)和载脂蛋白E (ApoE)是大脑中主要的胆固醇转运体，在维持胆固醇稳态中起重要作用。ABCA1/ApoE在脑卒中后神经恢复中的作用已被许多研究报道。创伤性脑损伤后的一些上调可能有保护作用，而一些只是反应性的。T4治疗后，可能因为血脑屏障完整性、血管病理和脑水肿减轻，这些上调被逆转。部分蛋白TBI后表达下调，T4处理后明显上调，但大部分蛋白TBI后表达下调不明显。在这些蛋白中，Nefm和Nefl富含GO，如再生和轴突生成，这可能表明T4处理有助于神经再生。细胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase, Mtco1)是线粒体电子传递链中用于氧化磷酸化的一种酶，T4处理后其表达上调，暗示线粒体功能恢复。结合富集氧化石墨烯，T4治疗可改善脑炎症、水肿和血脑屏障损伤，参与神经再生、胆固醇转运、中间丝组织和线粒体功能通路。

结论

基于iTRAQ蛋白质组学分析，我们建立了创伤性脑损伤后蛋白质变化的数据集。PRM方法验证了Ttr等蛋白质是TBI的可靠生物标志物或治疗靶点。蛋白质组学分析也揭示了TBI后T4治疗的途径和差异蛋白。iTRAQ蛋白质组学技术可以有效地促进重要差异蛋白的探索，有助于疾病机制的检测。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33504361/

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